Д-р Рейчъл М. Холдън

животински

3048C Etherington Hall, Queen’s University

Кингстън, Ont. K7L 3V6 (Канада)

Тел. +1 613 533 3134, факс +1 613 533 3292

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Модели на гризачи за хронична бъбречна болест и съдова калцификация

Хроничното бъбречно заболяване (ХБН) е световен здравен проблем с нарастваща честота и лоши резултати. Сърдечно-съдовите заболявания (ССЗ) са признати за важна причина за заболеваемост и смъртност при пациенти с ХБН. При пациенти в краен стадий на бъбречно заболяване (ESKD), наличието и степента на артериална калцификация независимо предсказва последващо ССЗ и смъртност извън установените конвенционални рискови фактори [1,2]. Новият напредък в технологиите, въпреки техните ограничения, увеличиха нашето разпознаване на степента на съдова калцификация при пациенти с ХБН; неинвазивните техники като компютърна томография ни позволиха да определим количествено степента на калцификация. Проучванията последователно показват, че повечето пациенти с ESKD имат значителна калцификация в коронарните артерии и аортата, а близо 50% имат клапна калцификация [3].

Животинските модели допринесоха за нашето разбиране, че съдовата калцификация при определянето на ХБН е активен процес

Калцификацията се случва на две места в артериалната стена: в интимата и средата. Калцификацията на интимата е неравномерна, свързана със съдови гладкомускулни клетки (VSMCs) и макрофаги в богати на липиди области на артерии и е под формата на атеросклеротично съдово заболяване. Калцификацията на интимата е свързана с класически рискови фактори на Framingham като напредване на възрастта, диабет, дислипидемия, хипертония и тютюнопушене. За разлика от това, медиалното калциране се появява в еластичните области на артериите и почти изключително се свързва с VSMC [4]. Интималното и медиалното калциране могат да се появят независимо един от друг и поради това се смята, че представляват различни патологични процеси. При млади възрастни пациенти с ХБН калцификацията на медиалната стена преобладава почти изключително [5] и нейното присъствие е свързано с аномалии в метаболизма на минералите, които се появяват в стадия 3 на ХБН (хиперфосфатемия) и лечението му (фосфатни свързващи вещества на висш D).

Нарастват in vitro и in vivo доказателства, че хиперфосфатемията и извънклетъчният калций стимулират фенотипната трансформация на VSMC [4,6]. Установено е, че VSMCs проявяват отличителни фенотипи, включително контрактилен фенотип, характеризиращ се с маркери на линията на гладката мускулатура (SMAD6, матричен Gla протеин (MGP), α-гладък мускул актин), както и фенотипове, характеризиращи се с остеохондрогенна диференциация и формиране на костите ( sox-9, фактор, свързващ сърцевината-α1, остеокалцин) [7,8]. В условията на повишени нива на фосфор, както се случва при ХБН, последният фенотип става все по-разпространен. Редица експерименти с нокаут на гени, използващи животински модели, потвърдиха, че съществуват протеини, получени от VSMC и кости, които или инхибират, или насърчават процеса на калциране. Моделите за селективно избиване на гени за костно-свързани протеини като остеопротегерин [9] или селективни модели за избиване на гени на VSMC протеини като smad6 [10] и MGP [11] развиват различна степен на артериална калцификация. Дали съществува окончателен общ път в развитието на съдовата калцификация, ще са необходими по-обширни експерименти в животински модели на ХБН.

Моделите с ХБП при животни развиват калцификация на съдовете

Изследванията относно прогресирането на промените в ХБН са установили забележителна последователност на фенотипите между животните и хората. Общото за всички модели е повишен плазмен креатинин, повишен азот в уреята в кръвта, хиперпаратиреоидизъм и хиперфосфатемия. Тези модели на гризачи на ХБН обаче генерират редица тежести във фенотипа на съдовата калцификация, вероятно поради липса на последователност в генетичния фон, степента на увреждане на бъбреците, времето на изследване и диетичния режим.

Въпреки че има присъщи разлики между тези три модела, всяко предизвикателство генерира определено ниво на ХБН след първоначално остро увреждане на бъбреците и развитието на съдова калцификация може или не може да доведе до следващите 4–36 седмици (таблици 1, 2, 3, 4). Степента на съдова калцификация, която се развива в рамките на тези модели, обикновено се открива чрез химичен анализ на тъканите, последван от качествена процедура за оцветяване на тъканите за локализация. В повечето случаи тъканният калций се елуира с киселина и супернатантата се измерва с помощта на крезолфталеинов о-комплексен метод или атомна абсорбция. Разлагането на тъкан с киселина обаче води до разрушаване на тъканите и дали повишеното съдържание на калций е представително за действителното калциране или просто излишъкът от калций изисква потвърждение чрез оцветяване на фон Коса на предварително фиксирани аортни секции. Въпреки че са използвани различни техники за визуализация, включително оцветяване с ализарин в червено на цели тъкани, само количественото определяне е недостатъчно за оценка на калцирането на аортната тъкан.

маса 1

Резюме на проучвания, използващи модела 5/6 нефректомия (без витамин D)

Таблица 2

Резюме на проучвания, използващи модела 5/6 нефректомия с витамин D

Таблица 3

Резюме на проучвания, използващи модела на електрокаутери на мишки

Таблица 4

Резюме на проучвания, използващи адениновия модел

Моделът 5/6 за нефректомия на ХБН

Всички вариации на този модел намаляват общата маса на бъбреците с 5/6th. Най-често срещаната техника е двустепенна процедура, която изисква отстраняване на двата полюса на един бъбрек (2/3 от първия бъбрек), последвана от пълна нефректомия на противоположния непокътнат бъбрек 1 седмица по-късно. Таблица 1 се отнася до проучвания за резултатите от съдовата калцификация, които сравняват 5/6Nx животни с фалшиви контроли. Основните разлики между проучванията са продължителността на ХБН, използвана в проучването, и диетичната концентрация на калций и фосфат.

Установено е, че моделът 5/6Nx произвежда серумни нива на креатинин, които са средно 2,2 пъти по-високи от контролните животни (таблица 1). Без едновременната употреба на витамин D, плъховете 5/6Nx развиват нива на фосфор 8 седмици след операцията, които варират до 2,6 пъти по-високо от контролните животни (с изключение на едно проучване, което отчита 3,8-кратно увеличение), при диетични режими съдържащ между 0,9 и 1,2% тегловни фосфор. Въз основа на Американския институт по хранене, нормалният хранителен фосфор за плъхове е около 0,3% (в зависимост от използваната формула) [16]. Хиперпаратиреоидизмът е характеристика на този модел, като проучванията отчитат увеличение между 2,4- и 77 пъти над контролните животни, докато серумният калций е минимално променен.

Ejerblad et al. [13], използвайки 5/6Nx при плъхове Sprague-Dawley (SD), са първите, които съобщават за калциране на аортата след 12–36 седмици, използвайки диета, съдържаща фосфор с тегло 1% (таблица 1). Интересното е, че данните предполагат, че без диета с високо съдържание на фосфор, често използваният щам SD плъхове е бил устойчив на съдова калцификация. Например, от 8 проучвания, които са определили количествено съдържанието на аортен калций, само в 1 проучване [17] е имало дори незначително увеличение на съдържанието на аортен калций при използване на диета, съдържаща по-малко от 1% фосфор (таблици 1, 2). Следователно, или високо диетичният фосфор (т.е. 1,2% фосфор в диетата за периоди> 12 седмици) или използването на средство, което насърчава артериалното калциране, като 1,25 (OH) 2D3 (калцитриол), се превърна в обща съставка на този модел.

Таблица 2 съдържа данни, обобщаващи различните проучвания, които позволяват сравнение на различни режими на лечение (калцитриол, аналози на витамин D, калцимиметици и фосфатни свързващи вещества) при животни с ХБН. В модела 5/6Nx едновременното приложение на витамин D изглежда води до концентрации на циркулиращ фосфор, които са около 1,8 пъти по-високи в сравнение с фалшиво третирани животни и 1,3 пъти по-високи при животни с ХБН, които не получават витамин D. Само леко повишаване на калция ( -/-) или ускорена атеросклероза (нокаут на аполипопротеин Е (апоЕ -/-); таблица 3). В модела на електрокаутери на мишки, ХБН се предизвиква от хирургична аблация на бъбреците. Това е процедура от две стъпки; първоначално кората на единия бъбрек е електрокаутеризирана, като се внимава да не се разрушат надбъбречните жлези и хилумът на бъбреците. Една седмица по-късно, след като животните се възстановят, вторият бъбрек се нефректомира. Изглежда, че тази процедура води до променлива тежест на ХБН с нива на урея в кръвта, вариращи от 1,5 до 4,8 пъти по-високи от нормалните животни (таблица 3). Тези животни също развиват хиперпаратиреоидизъм (∼ 3-кратно увеличение на PTH), но хиперфосфатемията не винаги е налице и най-много е 1,5-кратно увеличение спрямо нормалното, дори когато се комбинира с висок хранителен фосфор (1,65% тегловни фосфор).

Съдова калцификация не е докладвана последователно при мишки от див тип с ХБН. Въпреки това се развива обширна калцификация при LDLR -/- и апоЕ -/- трансгенни мишки, използващи този модел на електрокаутеризация. Моделът LDLR -/- CKD прилича на клинична уремия с асоцииран метаболитен синдром, тъй като тези мишки имат затлъстяване, хипертония, инсулинова резистентност и ранен диабет тип 2. LDLR -/- мишките без ХБН имат предразположение към ускорена съдова калцификация и атеросклероза при диета с високо съдържание на мазнини; добавянето на ХБН обаче води до 1,5 до 2,6 пъти увеличение на аортното съдържание на калций (таблица 3). По същия начин, апоЕ -/- мишките, хранени с редовна диета, генерират ускорена атеросклероза под формата на увеличено заболяване на интимата, както и медиално калциране, което става умерено повишено, когато се индуцира ХБН при тези животни.

Диетичните фосфатни свързващи вещества и костният морфогенен протеин-7 намаляват съдовото калциране в модела за електрокаутерична мишка

При този модел фосфорните свързващи вещества, независимо дали са на калциева основа (т.е. калциев карбонат) или не на калциева основа (т.е. севеламер), изглежда намаляват нивата на фосфор (варират от 28 до 42% намаление) и демонстрират постоянно намаляване на аортния калций съдържание в сравнение с нелекувани животни с ХБН при LDLR -/- и апоЕ -/- нокаути [27,28,29]. Интересното е, че фосфорното свързващо вещество севеламер е способно да намали калцификацията на интимата при апоЕ -/- CKD мишки и следователно може също така да предотврати прогресирането на атеросклерозата в този модел [27]. Добре известно е, че севеламерът намалява нивата на холестерола при хората, което предполага, че може да съществува полза от понижаването на фосфора от това лекарство [30,31,32]. Констатациите в електрокаутеричния модел на мишка са в съответствие с моделите 5/6Nx и аденин при ХБН [17,33] (таблици 2, 3).

Дейвис и др. [34,35] са изследвали връзката между остеодистрофия с нисък оборот и съдова калцификация при LDLR -/- мишки с ХБН, получаващи диета с високо съдържание на мазнини. костният морфогенен протеин-7 (BMP-7) е важен регулатор на костното ремоделиране и развитие. Възстановява анаболния баланс на костите, като стимулира образуването на кости и намалява серумния фосфор чрез повишено усвояване в костите. Лечението с BMP-7 понижава серумния фосфор и предотвратява индуцирана от CKD съдова калцификация. Независимо дали намаленият серумен фосфор се постига чрез фосфатно свързващо вещество (на основата на калций или севеламер) или средства, които стимулират образуването на кости (BMP-7), резултатът е намалено съдово калциране в този миши модел на ХБН.

Модел Аденин плъх

Моделът на аденин наскоро привлече вниманието поради относителната лекота на дизайна и окуражаващите резултати. В рамките на 4 седмици при 0,75% аденинова диета се съобщава за калциране на туниката на аортата и в комбинация с диета с ниско съдържание на протеини резултатът от калцификацията е по-последователен [36]. Този модел, за разлика от останалите модели, не се нуждае от операция и има висока степен на оцеляване. Както е показано в таблица 4, след 4 седмици аденинова диета, нивата на креатинин са 3,0 до 10,5 пъти по-високи от контролните животни. Нивата на серумен фосфор варират от 1,2 до 2,6 пъти по-високи от нормалните при тежък вторичен хиперпаратиреоидизъм въпреки минималните колебания в серумния калций (таблица 4).

С диетични концентрации на фосфор, вариращи от 0,4 до 1,2%, моделът на аденин произвежда най-високите серумни нива на фосфор, вероятно отчасти поради тежестта на бъбречното увреждане. С тежестта на ХБН, произведена в този модел, съдовата калцификация постоянно се генерира без допълнителен калцитриол (както в модела 5/6Nx) или генетична предразположеност към калцификация (както в модела на електрокаутери на мишки). Въпреки това, в тези проучвания, които съобщават за загуба на тегло, плъхове, хранени с 0,75% аденин, губят до 50% от първоначалното си тегло в рамките на 5 седмици на диета [36,37,38]. Дали широкото наблюдавано медиално калциране се дължи отчасти на загуба на тегло и свиване на обема или самият аденин остава да се определи.

Моделът на аденин е използван за изследване на ролята на фосфатното свързващо вещество севеламер и бисфосфонатите (ибандронат, етидронат, памидронат и алендронат) при модифицирането на фенотипа на съдовата калцификация (таблица 4). В сравнение с животни с ХБН, получаващи само аденин, тези лечения доведоха до значително намаляване на аортното съдържание на калций (99% намаление с ибандронат и 84% намаление със севеламер).

Основното предимство на адениновия модел е, че той не изисква операция за генериране на тежка ХБН. Основният недостатък е загубата на тегло, която настъпва, когато плъховете получават диета, съдържаща 0,75% аденин. Въпреки това, в скорошен доклад за модифицирана версия на адениновия модел загубата на тегло не е проблем. Вместо да използват аденинова диета на базата на чау, Terai et al. [39] перорално дозиран аденин при 600 mg/kg/ден в продължение на 10 дни като първоначална остра обида за предизвикване на ХБН при плъхове Wistar. При нормална диета със или без висок фосфат (т.е. без аденин в диетата) тези плъхове нарастваха стабилно през 15-седмичния период на изследване и развиха прогресираща бъбречна недостатъчност. След 8 седмици на ХБН само 12,5% са имали съдова калцификация, но след 15 седмици 37,5% от животните развиват съдова калцификация.

Други модели

Сравняване на проучвания върху животински модели с клинични изпитвания при хора с ХБН

Има няколко рандомизирани контролирани проучвания, изучаващи резултатите от съдовата калцификация при хора с ХБН, въпреки документацията за степента на клиничния проблем. Изследването „Treat to-Goal“ [42] сравнява две диетични фосфатни свързващи вещества (sevelamar спрямо фосфатни свързващи вещества на основата на калций) при пациенти с ESKD. В съответствие с констатациите в модела за електрокаутериране на мишки [27,29] и модела на аденин [33], хората с ESKD, рандомизирани на севеламер, са имали по-бавна скорост на натрупване на калций в коронарните артерии и аортата след 1 година лечение. Тези резултати бяха допълнително потвърдени в проучване, изследващо пациенти с инцидентна диализа [43]. И в двете проучвания лечението с фосфатни свързващи вещества на основата на калций изглежда повишава калцификацията.

Ролята на витамин D в насърчаването или предотвратяването на калциране при пациенти с ХБН остава противоречива. В модела 5/6Nx приложението на калцитриол ясно ускорява отлагането на калций в тъканите, което е донякъде подобрено с аналози на витамин D. Установихме, че употребата на витамин D е свързана или с липсата на, или само с леко повишаване на нивата на калций, предполагаемия механизъм, чрез който витамин D може да ускори съдовата калцификация. Следователно, резултатите от тези проучвания върху животни предполагат, че витамин D може да има пряк ефект върху самата съдова клетка на гладката мускулатура. По-нататъшното проучване на тази концепция в животински модели е от решаващо значение за грижите за бъбречно болни, като се има предвид честотата, с която на пациентите с ESKD се предписват препарати с витамин D.

Понастоящем ролята на калцимиметиците в модифицирането на калцификацията на коронарните артерии при хора е в рандомизирано контролирано проучване [44]. Предклинични данни, показващи полза, едва се появяват, но липсва публикувано проучване при хора, оценяващо ролята му в калцификацията. Както е демонстрирано в модела 5/6Nx [21,22,45], може да има роля за този антагонист на сензорния рецептор за подобряване на съдовата калцификация при хората, вероятно чрез добре описаната му способност да понижава серумния калций и фосфат или може би чрез неговата потенциалът да регулира MGP, протеинът VSMC се счита за най-важният локален инхибитор на съдовата калцификация.

Две проучвания върху животни (5/6Nx и аденин) показват, че бисфосфонатите подобряват калцификацията [23,36]. Предварителните доказателства при хора с ХБН потвърждават тези открития и са в ход рандомизирани контролирани проучвания, оценяващи този резултат [46].

Заключение

В заключение, животинските модели са полезни за изследване на свързана с ХБН съдова калцификация и резултатите, получени в тези предклинични проучвания върху животни, изглежда превеждат на доказателствата, макар и ограничени, съществуващи при хора с ХБН. Моделите на трансгенни мишки доказаха своята полезност при изучаване на потенциалните механизми, залегнали в основата на биологичния процес, докато проучванията при плъхове са полезни за изучаване на естествената история на процеса и леченията, които могат да го модифицират. Като правим наблюдения, направени при хора при ХБН и подлагаме тези наблюдения на контролирани експерименти върху животни, може да сме в състояние да разберем и контролираме по-добре епидемията от ССЗ при пациенти с бъбречно заболяване.