Резюме

Въведение

За да предоставим това сравнение на методите, ние се фокусирахме върху вълка от Александърския архипелаг (Canis lupus ligoni) като казус. Вълкът от Александърския архипелаг многократно е бил ходатайстван да бъде включен в списъка като застрашен съгласно Закона за застрашените видове в САЩ (ESA). Тези вълци се срещат в относителна географска изолация в Югоизточна Аляска, където продължаващият натиск от загуба на местообитания, намаляване на популацията на тяхната основна плячка и добив на вълци пораждат загриженост за бъдещето на населението. Оценките на популацията на вълци в регионален мащаб в югоизточна Аляска се основават на очакваното изобилие от черноопашати елени (Odocoileus hemionus sitkensis) при предположението, че вълците са тясно свързани с изобилието на тяхната основна плячка. Това е видно от най-новия преглед на състоянието на видовете ESA, където са използвани показатели за качеството на местообитанията на елени за прогнозиране на изобилието от вълци (US Fish and Wildlife Service 2015).

сравнение

Вълците на остров Принц на Уелс (POW) (фиг. 1) бяха особено обезпокоителни при последната оценка (2015 г.), тъй като в допълнение към високите нива на реколта от вълци, POW има най-висок процент на дърводобив със стария растеж в Югоизточна Аляска (Albert and Schoen 2013, Person and Brinkman 2017). Предполага се, че популациите на елени ще намаляват, тъй като старите гори с вкусни подлесни растения и храсти се превръщат в гъсти, дори на възраст, затворени балдахинови гори (Alaback 1982, Schoen et al. 1988, Person et al. 1996, Farmer and Kirchhoff 2007, Gilbert et al. 2016, Person and Brinkman 2017, Porter 2018), които са силно избягвани от елени (Wallmo and Schoen 980, Kohira and Rexstad 1997, Gilbert et al. 2017). Елените са най-често срещаните видове плячка за вълка от архипелага Александър въз основа на предишни изследвания, проведени върху военнопленници (Kohira 1995, Person et al. 1996, Kohira и Rexstad 1997). Въпреки това, механичното сортиране на вълчи скати разкрива друга плячка в значителни количества (Kohira 1995) и крайбрежните вълци в този регион могат да консумират значителни количества сьомга сезонно и други морски ресурси (Szepanski et al. 1999, Darimont et al. 2003, 2004, 2008a, Lafferty et al. 2014), предполагащи, че изобилието от популации на вълци може да бъде продиктувано и от наличието на плячка, различна от елени. Следователно, усъвършенстването на знанията относно диетата на вълците в системата има важни последици за управлението на вълците, потенциалните съображения на ЕКА и управлението на горите в югоизточна Аляска.

Карта на проучваната зона, показваща архипелаг Александър в Югоизточна Аляска. Червените и жълтите точки представляват отделни места за събиране на скат. Повечето колекции от скат са концентрирани на остров Принц на Уелс (жълти точки).

Тук предлагаме първото официално сравнение на диетичния анализ на месоядни животни с механично сортиране и метабаркодиране на ДНК, използвайки опортюнистично събрани скати в предполагаем спектър на разграждане в умерена дъждовна гора, която е враждебна към запазването на ДНК. Проучихме дали метабаркодирането разкрива по-разнообразна диета от вълци, отколкото механичното сортиране, постигна ли повишена таксономична точност и идентифицира рядко консумираните видове плячка. Включихме както скати, които изглеждат силно деградирали, така и тези, които изглеждат свежи, и оценихме дали възрастта на скатите или отклоненията, въведени по време на молекулярната обработка, повлияха на диетичния профил, показан от метабаркодирането. Допълнително анализирахме в детайли диетата с вълци от Александър Архипелаг с особен акцент върху остров Принц на Уелс, за да определим профила на плячката на вълците и тяхната зависимост от елените.

Материали и методи

Проучвана област и полево събиране

Югоизточна Аляска се намира в архипелага Александър, съставен от над 2000 имена острови (фиг. 1) (Cook et al. 2006). Този регион получава между 130 - 400 cm валежи годишно (Shanley et al. 2015), като по този начин го прави особено негостоприемен за запазването на ДНК в открити проби от околната среда. Сушата е подплатена от сурови крайбрежни планини и обширни умерени дъждовни гори на по-ниски височини. В резултат на естествената фрагментация и изолация, регионът на севернотихоокеанския бряг поддържа много ендемични растителни и животински линии, особено на остров Принц на Уелс, най-големият остров в архипелага (Cook et al. 2006, MacDonald and Cook 2007, Smith 2016) . По-голямата част от залесената площ е в рамките на Националната гора Тонгас, стопанисвана от Службата по горите на САЩ. Тази екосистема е домакин на разнообразие от бозайници, включително емблематични видове като черна опашка на Sitka (Odocoileus hemionus sitkensis), американска черна мечка (Ursus americanus), северноамерикански бобър (Castor canadensis), американска куница (Martes americanus), планинска коза (Oreamnos) americanus), морски лъв Steller (Eumetopias jubatus), пристанищен тюлен (Phoca vitulina) и лос (Alces alces). Разпространението и сглобяването на видове варират в различните островни и континентални райони на този регион.

Събрахме вълчи парчета по маршрути за пътуване на вълци, в близост до места за бърлоги и по второстепенни пътища по време на планираните проучвания за събиране на скат през октомври 2014 г. - декември 2015 г. (фиг. 1). Събирахме вълчи парчета предимно на остров Принц на Уелс (55 ° 46’45.9480 ”N; 132 ° 49’ 4.7748 ”W) (n = 145), но също така и опортюнистично събрани проби в други континентални и островни системи (n = 38). Оценихме възрастта (прясна [3 месеца]) на скат въз основа на външния вид, времето от последното посещение на обекта (Ciucci et al. 1996) и времето на експозиция, като се има предвид, че скатите се разлагат бързо в среда на тропически гори (Wallmo et al. 1962, Ciucci et 1996, Darimont et al. 2008b) (Фиг. 2). Събраните вълчи парчета се съхраняват в найлонови торбички, обозначени с местоположение, дата и възприемана възраст на скат и след това се замразяват (-20 ° C). Замразените скатове са изпратени до държавния университет в Орегон за подготовка и анализ на пробите.

Примери за вълчи скати, събрани в югоизточна Аляска близо до остров Принц на Уелс. Левостранните панели (a, c и e) са примери за пресни скати (на 3 месеца). Възрастта се определя от колекционера; скатове бяха събрани през 2014–2015.

Механично сортиране

Снимки, изобразяващи примери за фини резултати от механично сортиране на видове плячка във вълчи скатове, събрани в Югоизточна Аляска, 2014-2015. Започвайки от горния ляв панел и движейки се по посока на часовниковата стрелка, показаните видове са сьомга, черна мечка, плешив орел, пристанищен тюлен и скулп.

Молекулярен анализ

Използвайки съхранените подпроби от всяка скат, ние извличаме ДНК от всяка проба, използвайки Qiagen DNeasy Blood and Tissue kit (Qiagen, Hilden, Германия) с леки модификации, както следва: 500 ul буфер ATL, 50 ul протеиназа К и 1,0 mm цирконий/Кърнички от силициев диоксид (BioSpec Products, Bartlesville, ОК) бяха добавени към епруветката от 1,7 ml, съдържаща скат. Пробите се завихряха за 10 минути на максимална скорост преди инкубация при 56 ° С в продължение на 4-6 часа. ДНК се елуира в общ обем от 100 ul. Извлича се отрицателна контрола с всеки кръг (приблизително 17 проби) на ДНК екстракция, за да се идентифицира възможно кръстосано замърсяване.

След първоначалната PCR, всички PCR ампликони бяха почистени с помощта на PCRClean DX твърдофазни обратими имобилизационни магнитни перли (Aline Biosciences, Woburn, MA). Всяка PCR реакция се определя количествено с помощта на комплект за количествено определяне на dsDNA Accublue с висока чувствителност (Biotium, Fremont, CA) и се нормализира до 6 ng/ul. След това всяка група от 384 PCR продукта се обединява в една библиотека, за общо 3 библиотеки. След това отделни библиотеки бяха маркирани с допълнителен индекс за идентифициране на 6 двойки основи, използвайки NEBnext Ultra II DNA Library Prep kit (New England Biolabs, Ipswich, MA). Събраните проби бяха анализирани на биоанализатор, за да се потвърди размерът на фрагмента. След това библиотеките бяха секвенирани в едната лента на Illumina HiSeq 3000 2 × 150 bp PE в Центъра за изследване на генома и биокомпютри в Орегонския държавен университет.

Анализ на последователността

Четенията на сурова последователност бяха анализирани с помощта на тръбопровод за биоинформатика, предназначен за изрязване и сортиране на четенията на последователността според идентифицирането на пробата от скат. Очертанията на биоинформатичния процес са както следва: (1) суровите четения се сдвояват с използване на PEAR (Zhang et al. 2013); (2) последвано от демултиплексиране, като се използват 8 последователности от индекси на основни парата, уникални за всяка проба (несъответствия се отхвърлят); (3) накрая, последователностите от всяка проба бяха групирани по 100% сходство и таксономично присвоени с помощта на BLAST срещу 12S гръбначни последователности в GenBank и от персонализирана база данни 12S.

Подобно на поетапните методи, използвани от De Barba et al. (2014), бяха проведени поредица от мерки за филтриране и контрол на качеството на таксономично зададени последователности. Първоначално премахнахме последователности, които бяха идентифицирани като Canis spp. и замърсители въз основа на броя на четенията в контролите без шаблон (които съдържат предимно човешко замърсяване). След това премахнахме реплики на проби, които не успяха да се амплифицират по време на PCR, което включва реплики на проби с по-малко от общо 400 четения на последователност. Сравнихме таксономичните задания с известната фауна в Югоизточна Аляска (MacDonald and Cook 2007), за да заменим нерегионалните видове, идентифицирани с BLAST, с тясно свързани регионални таксони. След това изключихме жертвите, които се срещат в по-малко от 2 от 3 PCR повторения. И накрая, комбинирахме онези реплики на проби, които бяха амплифицирани, така че четенията на последователностите бяха събрани за всеки вид в пробата и за цялата проба и елиминирахме последователности, които се появиха в по-малко от 1% от общите четения за отделна проба.

Възраст на скат

Преди обработката наблюдавахме значителни разлики между външния вид и качеството на скат (фиг. 2). Проведохме t-тестове, за да определим дали възприеманата възраст на скат, направен по време на събирането на полето, корелира със средното количество ДНК (ng/ul) в проба (измерено след нормализиране с помощта на комплект за количествено определяне на Accublue High Sensitivity dsDNA (Biotium, Fremont, CA)), общият брой четения на последователности в проба, включително дефекатора на вълка, или общият брой четения на последователности, с изключение на вълка.

Честота на възникване

Използвахме както честотата на поява (FOO), така и показателите за относително изобилие (вж. По-долу), за да опишем появата на плячка във вълча диета. FOO се изчислява, за да се определи кои видове плячка присъстват и колко често присъстват въз основа на броя на пробите. За методите на механично сортиране вид е присъствал, ако е имало доказателства (включително микроелементи) за вид плячка (например косми, кости, люспи и др.) В разпръсната проба. След това FOO се изчислява като делът на скат, в който се среща вид плячка. За метабаркодиране се установява наличието на вид от това дали четенето на последователност за даден вид е било открито в отделен скат след мерки за контрол на качеството. Сравнихме FOO от механично сортиране и метабаркодиране, като използвахме подмножеството от скати, анализирани и по двата метода (n = 104), но допълнително представяме анализ на диетата от всички скатове, събрани на остров Принц Уелс и близки околни острови (n = 118 метабаркодиране; n = 98 механично сортиране) за описване на диетата при военнопленни.

Относително изобилие

За да проверим дали метабаркодирането и механичното сортиране дават сходни показатели за относително изобилие на вид плячка в рамките на скат, сравнихме процента прогнозен обем от механично сортиране с относителното изобилие на четене (RRA) от метабаркодирането. RRA за всеки вид i се изчислява като, където ni, k е броят на последователностите на видовете плячка i в проба k, S е общият брой на пробите и T е общият брой на видовете. Сравнихме прогнозния обем на вид плячка от механично сортиране с RRA от метабаркодиране, използвайки проста линейна регресия (R Core Team 2018).

Както за анализа на честотата на поява, така и на относителното изобилие, ние преразгледахме допълнително резултатите от скати с несъответствия от метабаркодиране и механично сортиране, за да оценим дали метабаркодирането е открило много четения на последователности на алтернативен вид, който е неправилно присвоен от механичното сортиране и следователно вероятно е фалшиво положителен.