Принадлежност Институтите J. David Gladstone, Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

микробиома

Настоящ адрес: Катедри по микробиология и статистика, Университет на Орегон, Корвалис, Орегон, Съединени щати

Принадлежност Институтите J. David Gladstone, Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Принадлежност Институтите J. David Gladstone, Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати

Принадлежности Институтите Дж. Дейвид Гладстоун, Сан Франциско, Калифорния, Съединени американски щати, Институт за човешка генетика и Департамент по епидемиология и биостатистика, Калифорнийски университет в Сан Франциско, Сан Франциско, Калифорния, САЩ

  • Мариел М. Финукан,
  • Томас Дж. Шарптън,
  • Тимъти Дж. Лоран,
  • Катрин С. Полард

Фигури

Резюме

Цитат: Finucane MM, Sharpton TJ, Laurent TJ, Pollard KS (2014) Таксономичен подпис на затлъстяването в микробиома? Стигане до вътрешностите на материята. PLoS ONE 9 (1): e84689. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0084689

Редактор: Markus M. Heimesaat, Charité, Campus Бенджамин Франклин, Германия

Получено: 28 май 2013 г .; Прието: 26 ноември 2013 г .; Публикувано: 8 януари 2014 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена от Националната научна фондация (безвъзмездна помощ # DMS-1069303) и подарък от фонда на Сан Симеон. Финансова подкрепа за разработването на проект за човешки микробиом на NIH - Основен протокол за вземане на проби от микробиоми A (HMP-A) беше предоставена от Пътната карта на NIH за медицински изследвания. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Затлъстяването е сред определящите предизвикателства за общественото здраве на нашето време, като приблизително 3,4 милиона смъртни случая годишно се дължат на високия ИТМ [1]. Диетичните и начина на живот интервенции имат само умерени ефекти и не е ясно дали тези ползи продължават с времето [2]. По този начин съществува значителен интерес към алтернативни подходи за отслабване.

През последните години се появи вълнуваща нова теория, която предполага, че чревният микробиом може да предложи терапевтична цел. Подкрепяйки причинно-следствената роля на чревните микроби при затлъстяване, проучвания върху мишки показват, че затлъстяването може да се предизвика при слаби индивиди чрез фекални трансплантации от затлъстели индивиди [3], [4]. Докато механизмите, чрез които чревните микроби влияят върху ИТМ, са неизвестни, многобройни изследвания на чревния микробиомен състав както при мишки, така и при хора показват, че затлъстелите индивиди имат по-ниско съотношение на бактериите от вида Bacteroidetes към бактериите от вида Firmicutes, отколкото слабите индивиди [3], [5] - [7]. Доказано е също, че затлъстелите индивиди приютяват по-малко разнообразни бактериални съобщества [7], [8].

Както научната литература [9], [10], така и популярната преса [11] обявяват връзката на затлъстяването и относителното изобилие на Bacteroidetes срещу Firmicutes като силна находка. Въпреки това, няколко скорошни доклада поставят под въпрос силата на тази асоциация. Две големи проучвания не откриват връзка между затлъстяването и съотношението Bacteroidetes: Firmicutes [12], [13]. Освен това няколко публикации всъщност съобщават за по-високо съотношение на Bacteroidetes към Firmicutes сред затлъстелите индивиди [14], в пряко противоречие с първоначалните открития.

Консорциумът по проект за човешки микробиоми (HMP) събра най-големия съществуващ набор от данни, описващ микробиотата на здрави индивиди, с последователности, подготвени с помощта на строг контрол на качеството. Кохортата включва 16S рРНК секвениране на микробиоми на изпражнения от повече от 200 възрастни, живеещи в Хюстън и Сейнт Луис [15], и съдържа субекти с изчерпателна гама от стойности на ИТМ, включително 24 затлъстели () и 123 слаби () индивида. Тези данни предоставят възможност за изследване на противоречивите констатации относно таксономичния състав на чревния микробиом и затлъстяването.

Резултати

Съотношението Bacteroidetes: Firmicutes не е свързано със затлъстяване или ИТМ

Започнахме с опит да възпроизведем най-известния резултат, подкрепящ теорията, че индивидите със затлъстяване имат по-ниско съотношение на Bacteroidetes към Firmicutes в червата. Не открихме разлика между затлъстелите и слабите индивиди в относителното им изобилие от Bacteroidetes или Firmicutes (p = 0,30 и 0,86, съответно, по-тест).

Важното е, че неспособността ни да открием тези разлики не се дължи на недостатъчна статистическа мощ. С нашите размери на извадките и отчетените по-рано размери на ефектите е много малко вероятно да не сме открили връзка в данните за HMP, ако има връзка в популациите на Сейнт Луис и Хюстън. Например, като се използват размерите на ефекта от Turnbaugh et al. [7] за V6 региона на гена 16S rRNA при европейски американци бихме имали 96% мощност, за да открием разлика в относителното изобилие на Bacteroidetes и 80% мощност за Firmicutes. Тези изчисления на мощността отчитат факта, че делът на затлъстелите индивиди в кохортата на HMP е по-нисък, отколкото в [7].

Тъй като вредните последици за наднорменото тегло върху здравето се проявяват по продължение на континуума от стойности на ИТМ, а не точно над границата на затлъстяването (ИТМ), по-нататък потърсихме количествена връзка между непрекъснатата променлива на ИТМ и съотношението на Bacteroidetes към Firmicutes. Няма връзка (Фигура 1; линейна регресия p = 0,41) и това съотношение варира значително между индивидите, независимо от ИТМ.

Алтернативните количествени оценки на таксономичния състав също не са свързани с ИТМ

След това изследвахме възможността, че - за целите на откриването на асоциация с ИТМ - съотношението на Bacteroidetes към Firmicutes не обобщава адекватно таксономичния състав на чревния микробиом на ниво тип. По-конкретно, ние определихме количественото относително изобилие на петте основни бактериални фили във всяка проба и изградихме композиционен профил на ниво филум за всеки индивид. След това визуализирахме тези композиционни профили като функция на ИТМ. Няма видим сигнал (Фигура 2).

Всеки ред показва относителното изобилие от основна бактериална филация на червата в даден индивид. Физическите лица се подреждат според техния ИТМ.

След това, за да сме сигурни, че не сме пропуснали фин модел в този сюжет, използвахме статистически модел, за да изолираме ефектите на ИТМ от остатъчна дисперсия поради грешка при вземане на проби и измерване. По-конкретно, ние моделирахме трансформацията на изометричното съотношение на логаритъма [17] на относителното изобилие на всеки основен тип във всяка проба, използвайки линеен модел, включително фиксиран ефект на филума плюс специфичен за филама ефект на ИТМ плюс случайна грешка. Отново не установихме значителна връзка между ИТМ и таксономичен състав на ниво тип.

След това разгледахме възможността BMI асоциация да съществува с по-фина таксономична резолюция, въпреки липсата на асоциация на ниво филум. За всеки индивид генерирахме нов профил на таксономичен състав, който измери количествено относителното изобилие на всеки бактериален род в микробиома на изпражненията на индивидите. Приложихме анализ на основните компоненти към тези профили на ниво род, за да намалим тяхната размерност, както в Smith et al. [18]. След това тествахме за връзка между ИТМ и някой от първите шест основни компонента (които обясняват 96% от вариацията в профилите на ниво род). Не открихме значими асоциации.

Освен това, за да гарантираме, че намаляването на основните компоненти не закрива асоциацията, използвахме логистична регресия, за да моделираме вероятността за наблюдение на всеки основен род като функция на ИТМ. Отново не намерихме асоциации.

Разнообразието на чревната микробиома в общността не е свързано с ИТМ

И накрая, изследвахме хипотезата, че ИТМ се свързва не с относителното изобилие на определени таксони, а по-скоро с разнообразието на наличните таксони. Тази възможност беше подкрепена от Turnbaugh et al. [7] и от Le Chatelier et al. [8], които и двамата стигнаха до заключението, че разнообразният чревен микробиом може да има защитен ефект срещу затлъстяването. Следвайки подхода на Turnbaugh et al. [7], използвахме 97% идентичност на оперативната таксономична единица (OTU) за изчисляване на последователността за всяка проба от HMP, за да изчислим кривите на разреждане. След това използвахме тези криви, за да сравним нивата на богатство (т.е. общия брой OTU) между затлъстели и слаби индивиди. За разлика от резултатите в [7] и [8], ние не открихме връзка между богатството и затлъстяването, а по-скоро наблюдаваме висока степен на остатъчна вариабилност в богатството на OTU при индивидите.

За да се уверим, че тези изненадващи резултати не са артефакт на измерване на разнообразието или процедура на изчисление, ние потвърдихме нашите констатации, използвайки мярката за ентропия на Шанън, както и различни софтуерни пакети за анализ на микробна екология (mothur [19], QIIME [20] и MetaPhlAn [21]). Този анализ на чувствителността потвърди, че резултатите от нашето нулево разнообразие са стабилни.

Ефектите на затлъстяването не са последователни при всички проучвания

За да гарантираме, че можем да възпроизведем значимите констатации от предишни анализи [6], [7], и за да преценим дали друго голямо, скорошно проучване с по-широк диапазон от стойности на ИТМ (MetaHIT [16]) може да помогне за изясняване на противоречивите резултати, ние преанализирани данни от [6], [7] и от датските субекти в [16]. Въпреки че първичните анализи на настоящия ръкопис бяха ограничени до V35 областта на гена 16S rRNA, ние също така включихме HMP данни от V13 региона, за да оценим възможността, че 16S-специфична пристрастност може да скрие истинската основна връзка.

На фигура 3 показваме, че вариациите в относителното изобилие на Firmicutes и Bacteroidetes са много по-големи при проучванията, отколкото при слаби и затлъстели индивиди в рамките на всяко проучване. Резултатите на MetaHIT и HMP не само не успяват да рекапитулират констатациите на Ley и Turnbaugh, но всъщност вървят в обратна посока. В данните за HMP тази констатация е последователна за V13 и V35 регионите на 16 S локуса, и двете от които са секвенирани при едни и същи индивиди на една и съща платформа (Roche 454). Значителната вариабилност между изследванията може да се дължи на неизмерен фактор като диета [22] или на технически фактори като техника на екстракция на ДНК, регион на целевия 16 S локус или платформа за секвениране [23]. Постоянната липса на BMI асоциация за регионите V13 и V35 в данните за HMP предполага, че 16 S регионът не е основен събеседник, поне в тази кохорта и за тези два променливи региона.

Данните Ley са от [6]. „Turnb“. данните са от Turnbaugh et al. [7], от афро-американци (AA) и европейски американци (EA), от променливи региони (V) 2 и 6. Данните MetaHIT са от датските субекти в [16], които нямат възпалително чревно заболяване. Данните за HMP са от V13 и V35. Отбелязваме, че основните резултати от този ръкопис са генерирани с помощта на данни от HMP V35. Всички p-стойности по -test.

Дискусия

Проучванията за трансплантация на фекалии при мишки категорично показват, че микробиомът има причинно-следствен ефект върху затлъстяването [3], [4], а редица високопоставени статии установяват, че затлъстелите индивиди имат по-ниски съотношения на Bacteroidetes към Firmicutes [3], [ 5] - [7]. И все пак ние и други не сме открили връзка между ИТМ и състава на нивото на чревния микробиом в мащабни анализи [12], [13]. Тези противоречиви наблюдения предполагат, че в микробиома на червата не съществува прост таксономичен подпис на затлъстяването.

Ограничение на нашите първични анализи е, че те са били ограничени до здравите субекти от кохортата на HMP, никой от които не е имал BMI 35. Например, ние предполагаме, че здравният екран на HMP може да е изключил индивиди с ниско разнообразие, като по този начин обърква способността ни да разпознават връзка между затлъстяването и богатството. Отбелязваме обаче, че датската кохорта MetaHIT включва = 12 (17%) пациенти с ИТМ 35 и въпреки това не разкрива връзка между затлъстяването и таксономичния състав на чревния микробиом.

Методи

Изтеглихме висококачествени, таксономично коментирани генни последователности на Roche V35 16 S rRNA от Центъра за анализ и координация на данни HMP (www.hmpdacc.org). Това са PCR-усилени V35 региони, секвенирани масово на инструмент Roche 454. Преди това тези последователности бяха обект на обширни анализи за контрол на качеството [15], включително подстригване, обезшумяване и филтриране на химера. За всяка последователност извличахме таксономични анотации и статистика за стартиране на ниво тип чрез RDP класификатор 2.2 [27], използвайки стандартния набор за обучение 032010 и таксономия и опцията за изходен формат „allrank“, съгласно HMP SOP. Поредиците с анотации със статистика за начална лента под 80% бяха третирани като „некласифицирани“. След това последователностите бяха картографирани към съответния им идентификатор на пробата HMP и използвани за изчисляване на относителното изобилие на ниво филум за всяка проба. За субекти с множество проби на изпражненията, тъй като няма данни за надлъжна ИТМ траектория, ние анализирахме пробата с най-голям брой четения. От общо 217 налични проби, ние изключихме пет проби с 1000 четения, намалявайки общия ни размер на пробите до 212 проби. Същият подход беше използван за получаване на HMP V13 16 S rRNA генни последователности.

Тествахме за връзки между относителното изобилие на рода arcsin квадратни корени и всички допълнителни количествени фенотипове от HMP. Не открихме значими асоциации (коригирани с FDR) в нито едно телесно място, в съответствие с ниския брой асоциации между микроби и фенотип, установени в [13] и подкрепящи валидността на нашите първични констатации относно ИТМ.

Данните на MetaHIT бяха съставени от метагеноми за пушки, които изтеглихме от Европейския институт по биоинформатика (www.ebi.ac.uk). Ограничихме нашия анализ до датските проби, които съдържаха дължини на четене от най-малко 75 базови двойки (bp) (= 70) и анализирахме на случаен принцип 20 M четения от всяка проба. Количествено определихме разнообразието на ниво микробиом от тези проби, използвайки базата данни STAP [28] и базата данни GreenGenes [29], за да идентифицираме метагеномни хомолози на 16 S локуса и класификатора RDP, за да обозначим таксономично тези последователности. Проведохме статистическа симулация, за да идентифицираме оптималните статистически прагове за стартиране на класификацията за класифициране на 16 S RNA метагеномични четения във фила, използвайки RDP класификатора. Накратко използвахме Grinder [30], за да симулираме 10 000 четения от 75 bp 16 S от базата данни STAP и базата данни GreenGenes, плюс 90 000 четения от 75 bp от кодиращите последователности (CDS) на 11 бактериални генома, произволно избрани от J. Craig Изчерпателна база данни за микробни ресурси на Venter Institute [31]. Всички четения подлежат на класификация с помощта на класификатора RDP. Установихме, че 70% праг на начален ремък засне 83% от симулираните 16 S последователности и правилно класифицира 99% от тези четения, докато филтрира всички, освен 0,001% от CDS четенията.

Публично достъпни, висококачествени 16 S ампликонни последователности, генерирани като част от проучванията Ley [6] и Turnbaugh [7], бяха изтеглени и обозначени таксономично. По-конкретно, изтеглихме 18 348 пълни 16 S, сглобени от последователности от пушки, генерирани в [6] от gordonlab.wustl.edu/microbial_ecology_ human_obesity/и 817 942 V6 хипервариабилни области и 1 191 519 V2 променливи области от 16 S РНК пиросеквениращи последователности, генерирани в [7] от gordonlab.wustl.edu/NatureTwins_2008/. Всички последователности бяха класифицирани във фила с помощта на RDP класификатора, както е описано по-горе.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: MMF TJS KSP. Анализирани данни: MMF TJS TL. Написа хартията: MMF TJS TL KSP.