Отдел по патобиологични науки, Училище по ветеринарна медицина, Университет на Уисконсин-Мадисън, Мадисън, Уисконсин, Съединени американски щати, Министерство на здравеопазването на Ню Йорк, Център Уодсуърт, Олбани, Ню Йорк, Съединени американски щати

тиопуриновото

Отделение по медицина към Университета на Уисконсин, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Настоящ адрес: EraGen Biosciences, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Отделение по медицина към Университета на Уисконсин, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Афилиации Уилям С. Мидълтън Мемориална болница за ветерани, Медисън, Уисконсин, Съединени американски щати, Медицински отдел, Университет на Уисконсин, Мадисън, Уисконсин, Съединени американски щати

Отдел по патобиологични науки, Училище по ветеринарна медицина, Университет на Уисконсин-Мадисън, Мадисън, Уисконсин, Съединени американски щати, Министерство на здравеопазването на Ню Йорк, Център Уодсуърт, Олбани, Ню Йорк, Съединени американски щати

  • Пей-Ин Лим,
  • Джули А. Кийтинг,
  • Спенсър Хувър,
  • Роб Страйкър,
  • Кристен А. Бернар

Фигури

Резюме

Цитат: Lim P-Y, Keating JA, Hoover S, Striker R, Bernard KA (2011) Тиопуриново лекарство инхибира производството на вируси от Западен Нил в клетъчната култура, но не и при мишки. PLoS ONE 6 (10): e26697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0026697

Редактор: Volker Thiel, Kantonal Hospital St. Gallen, Швейцария

Получено: 27 юли 2011 г .; Прието: 3 октомври 2011 г .; Публикувано: 24 октомври 2011 г.

Финансиране: Тази работа беше частично подкрепена от федерални средства от Националния институт по алергии и инфекциозни болести и Националните здравни институти (NIH) по 1U01-AI061193. Ядрото на животни BSL-3, което се финансира отчасти от Североизточния център за биозащита (U54-AI057158), беше използвано за проучвания върху животни, проведени в центъра на Уодсуърт. JAK беше подкрепен от финансираната от NIH програма за обучение на клетъчни и молекулярни паразитологии (2T32AI007414). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Семейството Flaviviridae се състои от три рода - Flavivirus, Pestivirus и Hepacivirus. Родът Flavivirus съдържа множество важни вирусни причини за човешката заболеваемост и смъртност. Например, четирите серотипа на вируса на денга (DENV-1, -2, -3 и -4) заразяват повече от 50 милиона души годишно [1], а вирусът на Западен Нил (WNV) може да причини тежко неврологично заболяване с енцефалитен случай смъртност от 18% [2]. Освен това няма ефективни антивирусни средства срещу нито един от флавивирусите.

Резултати

6MMPr инхибира производството на флавивирус в множество клетъчни линии

По-рано показахме, че 6MMPr е мощен инхибитор на HCV репликон и BVDV в клетки Huh7 [8]. Ние разширихме тези резултати, като изследвахме ефекта на 6MMPr върху вирусния растеж за членове на рода на Flavivirus (DENV, YFV и WNV) в няколко клетъчни линии. Човешки чернодробни и бъбречни клетъчни линии бяха инокулирани с DENV-2 или YFV в присъствието на различни концентрации от 6MMPr и продукцията на вируса беше измерена на 48 часа след инокулацията (hpi). Подобно на предишните ни резултати за BVDV, 6MMPr инхибира производството на вируси за DENV-2 и YFV с приблизително 10 пъти в клетки Huh7 (Фигура 1А). В допълнение, 6MMPr намалява вирусното производство с 10 пъти в клетките Huh6 (Фигура 1В), 100 пъти в клетките HepG2 (Фигура 1С) и 10 000 пъти в клетките HEK293T (Фигура 1D). По-голямото инхибиране на вирусното производство в клетки HEK293T не се дължи на лекарствената цитотоксичност в тези клетки (данните не са показани), което е в съответствие с предишните ни резултати, показващи, че 6MMPr до 500 µM не причинява цитотоксичност в говежди бъбречни клетки от Madin-Darby [ 8].

(A) Huh7, (B) Huh6, (C) HepG2 и (D) HEK293T клетки бяха инокулирани с DENV-2 (16681) или YFV в присъствието на различни концентрации от 6MMPr. Средата се събира при 48 hpi и вирусните титри се определят чрез флуоресцентни анализи на фокус. Бяха проведени поне два независими експеримента и са показани средните стойности ± стандартни отклонения от един експеримент, извършен в три екземпляра.

Сравнихме антивирусния ефект на 6MMPr срещу DENV-2 и WNV - два отдалечено свързани флавивируса. 6MMPr инхибира вирусното производство както за DENV-2, така и за WNV по дозозависим начин при 48 hpi във Vero клетки (Фигура 2А). При максимално инхибиране (20-50 µM 6MMPr), DENV-2 се инхибира 1000 пъти и WNV се инхибира 100 пъти. При всички тествани концентрации 6MMPr инхибира вирусното производство за DENV-2 в по-голяма степен, отколкото за WNV, приблизително 10 пъти (p Фигура 2. 6MMPr инхибира производството на DENV в по-голяма степен от производството на WNV.

Веро клетки се инокулират с WNV или DENV-2 (Нова Гвинея С) в присъствието на 6MMPr при (А) различни концентрации или при (В) 10 цМ. Средата се събира при (A) 48 hpi или (B) по различно време pi и вирусните титри се определят чрез анализи на плаки. Бяха проведени поне два независими експеримента и са показани средните стойности ± стандартни отклонения от един експеримент, извършен в (A) секступлети или (B) три повторения. Антивирусните ефекти върху WNV и DENV-2 бяха сравнени при всяка концентрация от 6MMPr в (A), а стойностите на P бяха ≤0,005 при всички тествани концентрации (1-50 µM).

Лечение на мишки с 6MMPr

Определихме ефекта на 6MMPr върху заболеваемостта и смъртността след подкожно (SC) инокулиране с 10 3 PFU на WNV с лечение, започващо непосредствено преди инокулация на вируса. Мишките бяха третирани веднъж дневно с контрол на носителя или 0,5 mg 6MMPr в продължение на осем последователни дни (дни 0–7 pi спрямо инокулацията с WNV). Всички инокулирани с WNV мишки (третирани с носител и третирани с 6MMPr) показват клинични признаци на заболяване и няма значителни разлики в началото на заболяването или смъртността между мишките, третирани с носител и третирани с 6MMPr (Таблица 1) Освен това, лечението с 6MMPr нямаше значителен ефект върху оцеляването на WNV-инокулирани мишки (P = 0.75) (Фигура 3А). Лечението с 6MMPr е довело до загуба на тегло както при имитирани инокулирани мишки, така и при инокулирани с WNV със средно 10% загуба на тегло след осем дневни лечения, а лечението с 6MMPr е влошило загубата на тегло поради болестта на Западен Нил, започвайки на 8-ми ден . Тези резултати показват, че лечението с 6MMPr не намалява заболеваемостта или смъртността поради болестта на Западен Нил и води до лека токсичност, проявяваща се като загуба на тегло.

Възрастни, женски C3H мишки са третирани с носител или 0,5 mg 6MMPr веднъж дневно в продължение на осем последователни дни (дни от 0 до 7 pi). Веднага след първото третиране, мишките бяха инокулирани SC в лявата задна подложка на крака само с разредител (фалшив; n = 4 на група) или с 10 3 PFU от WNV (n = 8 на група) и ежедневно наблюдавани за загуба на тегло и клинични признаци . (A) Данните за оцеляване са показани. Вирусната инфекция се потвърждава при всички оцелели от WNV чрез сероконверсия към WNV. (Б) Показани са средните стойности ± стандартни отклонения от процентното първоначално тегло. Значителни стойности на Р между инокулирани, третирани с 6MMPr мишки и WNV-инокулирани, третирани с 6MMPr мишки са посочени, както следва: *, P Таблица 1. Лечението с 6MMPr не повлиява заболеваемостта или смъртността при мишки, инокулирани с WNV.

Възможните обяснения за липсата на ефективност срещу болестта на Западен Нил от 6MMPr включват ниски концентрации на лекарства по време на ранна инфекция с WNV и/или лоша бионаличност в централната нервна система (ЦНС). По този начин проведохме проучване, за да изследваме ефекта от предварителната обработка с 6MMPr върху вирусни натоварвания в периферията и ЦНС. Мишките бяха предварително обработени с носител или 0,5 mg 6MMPr веднъж на ден в продължение на седем последователни дни, започвайки един ден преди вирусното инокулиране и вирусните титри бяха определени в серийни кръвоизливи от дни 1, 2, 3 и 4 pi и в тъкани, събрани на ден 6 пи. Третираната с 6MMPr група има 2 пъти по-нисък средногеометричен титър при пикова виремия (2 дни pi) от групата, лекувана с носител, но разликата не е значителна (P = 0,085) (Фигура 4А). Лечението с 6MMPr доведе до значително по-високи вирусни натоварвания в мозъка (P = 0,013), но не и в гръбначните мозъци, кожата на мястото на инокулация, дрениращите лимфни възли и далака (Фигура 4В). Загуба на тегло отново се наблюдава при третирани с 6MMPr мишки със значително по-големи загуби в дни 3–6 pi в WNV-инокулирани мишки в сравнение с имитираните мишки (P Фигура 4. Ефектът от 6MMPr-лечение на мишки по време на WNV инфекция е тъканно зависим.

Ефект на 6MMPr върху растежа на вируса в клетъчната култура

Приблизително 4 × 104 клетки/ямка се добавят към 24-ямкови плаки и се инкубират в продължение на 24 часа при 37 ° С. Клетките се изплакват с PBS и се инокулират с 10 4 PFU или FFU на вируса (множествеността на инфекцията е приблизително 0,25 въз основа на титруване върху Vero клетки). Веднага след добавянето на вирус, 6MMPr (Sigma-Aldrich, St Louis, MO) се добавя към културите в подходящата среда без FBS. След 1 h инкубация при 37 ° С, FBS се добавя, за да се получи 2% крайна концентрация на FBS, и клетките се инкубират при 37 ° С. По различно време pi, супернатантите се събират и съхраняват при -80 ° C. Производството на вируси се определя чрез флуоресцентни анализи на фокус или плака върху Vero клетки.

Антивирусни изследвания при мишки

Пет седмици, женски мишки C3H са закупени от Taconic (Germantown, NY), аклиматизирани за поне 1 седмица в съоръжението за животни на ниво биобезопасност-3 и им е дадена храна и вода ad libitum. 6MMPr се разтваря в стерилен PBS (клас на тъканна култура; Invitrogen) непосредствено преди третиране на мишки за всички изследвания. Мишките бяха инокулирани IP със 100 ul стерилен PBS (контрол на носителя) или 100 ul 6MMPr веднъж или два пъти на ден при определената доза. Мишките се претеглят и клинично се оценяват ежедневно. Процентното първоначално тегло е изчислено за оценка на загубата на тегло и 10% загуба на тегло се счита за значима. В нито едно от проучванията не са наблюдавани клинични признаци на лекарствена токсичност, като разрошена козина, прегърбване, слабост, затруднено дишане, асцит или дразнене на корема.

За проучването на заболеваемостта и смъртността, шест до седем седмични C3H мишки (14,7–19,7 g, средно тегло от 17,4 g) бяха третирани с PBS (контрол на носителя) или 6MMPr (0,5 mg/мишка) веднъж дневно в продължение на осем последователни дни. Веднага след първото третиране, мишките бяха инокулирани SC в лявата задна подложка на крака само с разредител (имитация; n = 4 на група) или 10 3 PFU от WNV (n = 8 на група), както беше описано по-рано [18]. Мишките се наблюдават ежедневно за загуба на тегло и клинични признаци, а мишките с тежко заболяване се евтаназират. Клиничните признаци включват разрошена козина, прегърбване, слабост и атаксия. Смята се, че една мишка има клинична болест на Западен Нил, ако е изпълнен поне един от следните критерии: 1) ≥10% загуба на тегло; 2) клинични признаци за поне два дни. WNV инфекцията е потвърдена при всички оцелени с WNV инокулирани чрез откриване на антитела срещу WNV, както е описано по-рано [18].

За оценка на вирусно натоварване в серуми и тъкани, мишки C3H на възраст от шест до седем седмици (16,6–19,8 g, средно тегло от 18,3 g) бяха третирани с PBS или 6MMPr (0,5 mg/мишка) в продължение на седем последователни дни и лечението е започнало един ден преди вирусното инокулиране. Мишките се инокулират с разредител (n = 3-4 на група) или WNV (n = 8 на група), както е описано по-горе, претеглят се ежедневно и серийно кървят три пъти чрез пункция на максиларната вена. Половината от мишките от всяка група бяха обезкървени в дни 1, 2 и 3 pi, а другата половина бяха обезкървени в дни 2, 3 и 4 pi, което доведе до 4 мишки на група в дни 1 и 4 и 8 мишки на група на дни 2 и 3. На 6-ия ден мишките бяха евтаназирани и тъканите бяха събрани и съхранени при -70 ° C. Тъканите се обработват, както е описано по-рано [18], и вирусни натоварвания в серуми и тъкани се определят чрез анализи на плаки върху Vero клетки. Инфекциозен вирус не е открит при фалшиво инокулирани мишки.

статистически анализи

Използван е двустранен U-тест на Mann-Whitney (GraphPad, Сан Диего, Калифорния), за да се тестват разликите между ефекта на 6MMPr върху растежа на DENV и WNV в клетъчната култура, вирусни натоварвания в серума и тъканите и загуба на тегло. Стойности от 333 PFU/ml за серум и периферни тъкани и 100 PFU/g за мозък и гръбначен мозък бяха използвани за изчисляване на геометричните средни стойности и стандартни отклонения за всякакви проби под границата на откриване за анализите на плака. За анализ на ефекта от лечението върху преживяемостта се използва анализ на оцеляването с логаритмичен ранг (GraphPad). За всички анализи P стойност <0,05 се счита за значима.

Благодарности

Бихме искали да благодарим на д-р Април Дейвис и г-жа Кристал Чадуик за съдействието при проучванията на мишките и на д-р Пей-Йонг Ши за предоставянето на WNV, произведен от клонинги. В допълнение, ние признаваме ядрото на тъканната култура на Центъра Wadsworth за подготовка на клетки, използвано в проучвания, проведени там.

Принос на автора

Замислил и проектирал експериментите: RS KAB. Изпълнява експериментите: PYL JAK SH. Анализира данните: PYL JAK KAB. Написа хартията: PYL RS JAK KAB.