Резюме

Въведение

В еукариотните клетки клиентите на HSP90 са, наред с други, ключовите медиатори на сигналната трансдукция и транскрипционната регулация (напр. NF-κB, STATs, p53) и киназите (напр. Raf/MEK/ERK, PI3K/AKT, p38/MAPK) . По този начин HSP90 играе централна роля в процеси като възпаление, растеж, оцеляване, диференциация и апоптоза (Trepel et al. 2010; Pratt and Toft 2003). Повишени нива на HSP90 са наблюдавани в злокачествени клетки и възпалени тъкани и затова HSP90 е особено изследван в контекста на лечението на рак и автоимунни/възпалителни заболявания (Ambade et al. 2014; Shukla and Pitha 2012; Li et al . 2013; Tukaj et al. 2013). HSP90 е насочен като нов терапевтичен подход при хепатоцелуларен карцином (HCC) (Breinig et al. 2009) и фиброза (Myung et al. 2009).

Освен трайна загуба на тегло, бариатричната хирургия помага за регулиране на метаболитните процеси, водещи до нормализиране на глюкозния толеранс, сенсибилизация на инсулина и увеличаване на енергийните разходи (Rubino et al. 2006; Buchwald et al. 2004; Rubino et al. 2010; Stefater et al. 2012 ). Зрелищните ефекти на бариатричната хирургия при дългосрочно намаляване на телесното тегло и подобряване на глюкозния толеранс при затлъстели индивиди стимулират развитието на нови хирургични техники (Kahn et al. 2006, Karcz et al. 2013). Дуоденално-йеюнален омега превключвател (DJOS), както се използва тук, е бариатрична процедура, при която дуодено-ентеростомия с проксимална верига се използва за заобикаляне на предното черво и позволява директна стимулация на задните черва (Nauck 2009; Rubino and Gagner 2002). DJOS като сравнително нова техника все още трябва да бъде проучена, за да се оценят нейните дългосрочни патофизиологични ефекти (Grueneberger et al. 2014; Traverso and Longmire Jr 1978). Следователно тук се използва животински модел, за да се отговори на въпроси относно ефектите на DJOS, които не биха могли да бъдат преследвани експериментално при хора.

Диетичните модели играят важна роля в етиологията и превенцията на рискови фактори като метаболитен синдром, T2DM и затлъстяване (O’Keefe et al. 2008). Диетата с високо съдържание на мазнини води до нарушения в експресията на възпалителни фактори и може да дерегулира адаптивния имунитет при затлъстяване (Makki et al. 2013; Rocha et al. 2008). Дългосрочното поглъщане с висококалорична диета пречи на инсулиновите сигнални пътища, води до увеличаване на периферната инсулинова резистентност и имунни нарушения (Cancello and Clément 2006). Известно е, че диетата с високо съдържание на мазнини и захар (HFS), приета в този експеримент, развива хипертония, нарушен глюкозен толеранс, по-високо отлагане на мазнини в корема, увеличена обиколка на корема и променен липиден профил (Poudyal et al. 2010). Храносмилането на различни видове диетични продукти има различни ефекти върху метаболизма, включително експресията на Hsps. В литературата не са открити доклади относно ефектите на HFS диета и бариатрична хирургия върху плазмените и чернодробните нива на HSP70 и HPS90. По този начин целта на това проучване е да се оцени ефектът от процедурата DJOS, комбинирана с диета с високо съдържание на мазнини и високо въглехидрати върху HSP70 и HSP90 плазмени и чернодробни концентрации при индуцирани от диета плъхове.

Материали и методи

Животни и диети

Всички експериментални процедури бяха одобрени от Местната комисия по етика, Катовице, Полша (58/2014). Методологията на DJOS е описана преди това от Karcz et al. 2013 и Stygar и сътр. 2018. Четиридесет и осем мъжки плъха Sprague – Dawley, първоначално тежащи между 250 и 275 g, бяха закупени от Центъра за експериментална медицина, Медицински университет в Силезия, Катовице, Полша. Животните бяха настанени в пластмасови клетки при контролирани условия (околна температура, 23 ° C; 12 часа цикъл светлина/тъмнина, светлини от 6:00 AM до 18:00 PM). Всички плъхове имаха свободен достъп до вода и храна. Контролната група се поддържа на професионална, редовна диета (Provimi Kliba AG, Kaiseraugst, Швейцария, 24% протеин, 4,9% мазнини, 7% сурова пепел, 4,7% сурови фибри). Затлъстяването се предизвиква чрез поддържане на животните на HFS диета (HFS 22,0 MJ/kg, 45% мазнини, 35% въглехидрати и 20% протеин (ssniff® EF R/M съгл. D12451 (II) мод., Ssniff Spezialdiäten GmbH, Германия ) за периода от 2 месеца преди и след операцията. Всички плъхове гладуват цяла нощ преди операцията.

Експериментален дизайн

След 1 седмица на аклиматизация, плъховете бяха разпределени в експерименталните групи: HFS диета (н = 28) и контролна диета (CD) (н = 28). Общата продължителност на експеримента беше 16 седмици. В продължение на 8 седмици преди и след операцията DJOS/SHAM, животните се поддържат на диетата им. Първоначалната част от процедурата, преди операцията, включваше 8 седмици поддръжка на експериментални диети. След този период и двете групи бяха допълнително разделени на подгрупи, които след това бяха подложени на два отделни вида операция: SHAM (н = 14) или DJOS (н = 14, фиг. 1а – в).

влиянието

Схема на експеримента. а Диетични модели, използвани преди и след операцията. б DJOS процедура. ° С ШАМ процедура

За втория етап от експеримента, през 8-те седмици след операцията, седем животни от групите DJOS и SHAM са били на същата диета, както преди провежданата операция (HFS/DJOS/HFS, HFS/SHAM/HFS, CD/DJOS/CD, CD/SHAM/CD) и още седем от всяка група са имали променена диета (HFS/DJOS/CD, HFS/SHAM/CD, CD/DJOS/HFS, CD/SHAM/HFS; Фиг. 1а). Броят на плъховете, включени в изследването, е минимализиран предвид „3Rs“ за хуманно отношение към животните (Russell and Burch 1959). Степента на оцеляване на животните по време на експеримента и след операцията е 100%.

Експериментални процедури

Събиране на тъкани и анализ на ELISA на HSP70 и HSP90

В края на 8-та седмица след операцията, съответстваща на 16-та седмица от експеримента, бяха събрани тъканни проби за измервания на HSP. Животните бяха анестезирани с 2% изофлуран и поток на кислород при 2 l/min при спонтанно дишане. Обезболяването се провежда с ксилазин. Кръвни проби се събират от коремната аорта, като се използват епруветки, съдържащи 10 μl EDTA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). След центрофугиране при 4000 об/мин в продължение на 10 минути при 4 ° C, плазмените проби се събират, замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при - 80 ° C, докато се извършат анализи.

Чернодробните тъкани бяха събрани и животните бяха подложени на евтаназия. Пробите от тъкани се приготвят чрез хомогенизиране и сонификация (15 s) върху лед, в буфер за лизис на тъканни клетки, съдържащ протеазни инхибитори (Gold Bio Technology, USA, MO). След това хомогенатите се центрофугират при 15 000ж за 15 минути при 4 ° С. Хомогенатите се замразяват бързо в течен азот и се съхраняват при - 80 ° C до по-нататъшен анализ. Концентрациите на HSP70 в плазмата и черния дроб се измерват с помощта на ензимно-свързан имуносорбентен анализ на плъх HSP70 (ELISA) Kit (Enzo Life Sciences, Inc., NY; ADI-EKS-715). Най-малката концентрация на HSP70, която може да бъде надеждно измерена чрез избран аналитичен комплект, е 90 pg/ml, с обхват на откриване 0,20–12,5 ng/ml; ADI-EKS-700B, минимална чувствителност 200 pg/ml (обхват на откриване 780–50 000 pg/ml) в съответствие с инструкциите на производителя. Концентрациите на HSP90 в плазмата и черния дроб бяха измерени с помощта на ELISA на плъх HSP90 (Wuhan USCN Business Co., Ltd. Продукт № SEA823Ra). Най-малката концентрация на HSP90, която може да бъде надеждно измерена чрез избран аналитичен комплект, е 0,055 ng/ml, с обхват на откриване 0,156-10 ng/ml. Всеки експеримент се извършва в два екземпляра.

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с използване на STATISTICA 13.1 PL (StatSoft, Краков, Полша). Всички тестове бяха двустранни и статистическата значимост беше определена на a стр стойност под 0,05. Данните за интервала са изразени като средна стойност ± стандартно отклонение. Разпределението на променливите беше оценено чрез теста на Шапиро-Уилк и графика квантил-квантил; хомогенността на дисперсиите е оценена чрез теста на Levene’s. За сравнение на данните е използван двупосочният параметричен ANOVA с post hoc анализ на контраста.

Резултати

HSP70 плазмени и чернодробни концентрации

Плазмените нива и чернодробните концентрации на HSP70 са били значително свързани с вида на диетата и взаимодействието между диетата и операцията, но не и със самата операция (Фиг. 2; Таблици 1 и 2).

Сравнение на плазмените нива на HSP70 (ng/ml) в групи, оперирани с SHAM и DJOS, подложени на различните диетични модели преди и след операцията. Съкращения: CD, контролна диета; HFS, диета с високо съдържание на мазнини и захар. Вертикалните линии изобразяват 95% доверителен интервал

DJOS срещу ШАМ

Значителни разлики в плазмените нива на HSP70 са наблюдавани за всички анализирани изследователски групи (Фиг. 2; Таблици 1 и 2). За концентрацията на HSP70 в черния дроб се наблюдават значителни разлики между CD/CD, CD/HFS и HFS/CD групи (Фиг. 2; Таблици 1 и 2).

DJOS хирургия

След операция DJOS плазмените нива и чернодробните концентрации на HSP70 са значително по-високи в групите, където диетата е променена след операцията (CD/HFS и HFS/CD) в сравнение с групите, които остават на непроменена диета (HFS/HFS, CD/CD) (Фиг. 2 и 3; Таблици 1 и 2).

Сравнение на концентрацията на HSP70 в черния дроб (ng/mg) в групи, оперирани с SHAM и DJOS, подложени на различните диетични модели преди и след операцията. Съкращения: CD, контролна диета; HFS, диета с високо съдържание на мазнини и захар. Вертикалните линии изобразяват 95% доверителен интервал

ШАМСКА хирургия

При оперираните с SHAM животни нивото на HSP70 в плазмата се увеличава значително в следните групи: CD/CD срещу CD/HFS срещу HFS/CD срещу HFS/HFS (Фиг. 2; Таблици 1 и 2), с най-ниското стойности на плазмен HSP70 в CD/CD групата (Фиг. 2; Таблици 1 и 2). Чернодробните концентрации на HSP70 са най-високи в CD/CD и HFS/CD групите. Стойността на този параметър беше значително намалена в CD/HFS групата в сравнение с CD/CD. Концентрацията на HSP70 в черния дроб е значително по-висока в групата на HFS/CD в сравнение с CD/HFS и HFS/HFS (Фиг. 3; Таблици 1 и 2).

HSP90 плазмени концентрации

Концентрациите на HSP90 в плазмата и черния дроб значително зависят от вида на диетата, използвана в експеримента, вида на операцията и взаимодействията между двата типа параметри (Таблица 1).

DJOS срещу ШАМ

Сравнението на плазмените концентрации на HSP90, събрани от DJOS и SHAM-оперирани животни, показва значителни разлики между CD/CD и HFS/CD групи, където стойностите на HSP90 са по-високи в пробите, събрани от SHAM-експлоатирани животни (Фиг. 4; Таблици 1 и 2).

Сравнение на плазмените нива на HSP90 (ng/ml) в групи, оперирани с SHAM и DJOS, подложени на различните диетични модели преди и след операцията. Съкращения: CD, контролна диета; HFS, диета с високо съдържание на мазнини и захар. Вертикалните линии изобразяват 95% доверителен интервал

DJOS хирургия

След операция DJOS, най-ниските стойности на плазмените нива на HSP90 са наблюдавани в CD/CD групата в сравнение с други комбинации от диета и хирургия (Фиг. 4; Таблици 1 и 2). Комбинациите от HFS диета (HFS/CD, HFS/HFS), приложени преди и след операцията, доведоха до повишаване на плазмените нива на HSP90 в сравнение с CD/CD и CD/HFS групите.

ШАМСКА хирургия

При оперираните с SHAM животни, подобно на DJOS групите, промяната в диетата от CD преди или след операция към диетата HFS доведе до значително увеличение на плазмените нива на HSP90 (Фиг. 4; Таблици 1 и 2).

HSP90 чернодробни концентрации

Чернодробната концентрация на HSP90 е свързана с вида на изследваната диета, вида на операцията и взаимодействието между тези параметри (Таблица 1).

DJOS срещу ШАМ

Чернодробната концентрация на HSP90 е значително по-висока при животни, оперирани с SHAM, в сравнение с плъхове, оперирани с DJOS, с изключение на групите с HFS/CD (Таблица 1).

DJOS хирургия

При животните, оперирани с DJOS, промяната на диетичния режим от CD на HFS след операцията или прилагането на HFS диета преди и след операцията доведе до значително увеличение на концентрацията на HSP90 в черния дроб (Фиг. 5; Таблици 1 и 2) . Най-ниското ниво на HSP90 се наблюдава в комбинациите с CD преди/след операцията, а най-високото в присъствието на HFS диета по време на всички експерименти (Фиг. 5; Таблици 1 и 2).

Сравнение на концентрацията на HSP90 в черния дроб (ng/mg) в групи, оперирани с SHAM и DJOS, подложени на различните диетични модели преди и след операцията. Съкращения: CD, контролна диета; HFS, диета с високо съдържание на мазнини и захар. Вертикалните линии изобразяват 95% доверителен интервал

ШАМСКА хирургия

Подобен модел на чернодробни концентрации на HSP90 се наблюдава и при групи, оперирани с SHAM, с най-ниски стойности в CD/CD групата и нарастващи от CD/HFS до HFS/CD и до HFS/HFS групи (Фиг. 5; Таблици 1 и 2). Няма значителни разлики при сравняване на CD/HFS и HFS/CD групите.

Телесно тегло

Видът на диетата и видът на приложената хирургическа намеса оказаха значително влияние върху телесното тегло на животните от анализираните проучвателни групи (Таблици 1 и 2).

DJOS срещу ШАМ

Всички групи, които консумират HFS (HFS/HFS) диета, имат значително увеличение на телесното тегло в сравнение с контролната група (CD/CD). Телесното тегло на животните, поддържани на HFS диета преди и след операцията, е значително по-високо при SHAM-оперираните животни в сравнение с DJOS (фиг. 6; Таблици 1 и 2).

DJOS хирургия

След DJOS, телесното тегло при HFS/HFS групата е значително по-високо в сравнение с CD/CD животни. Диетичният модел, който включва CD преди и HFS диета след операцията, повлиява телесното тегло на DJOS-оперирани животни в сравнение с профила на HFS/HFS.

ШАМСКА хирургия

След операция SHAM, животните, отглеждани на HFS/HFS, изразяват най-високото телесно тегло в сравнение с CD/CD, CD/HFS и HFS/CD групите. Използването на HFS преди операцията значително увеличава телесната маса в сравнение с CD/CD групата при животни, оперирани с SHAM.

Както съобщавахме по-рано (Stygar et al. 2018), промяната в диетата на по-калорична след операция DJOS не доведе до значителна загуба на тегло, когато операцията не беше комбинирана със стомашно ограничение. В нашето проучване ние забелязахме, че висококалоричната диета намалява ефектите от операцията, за разлика от други съобщени видове хирургични процедури (Mosinski et al. 2016).

Дискусия

Тук съобщаваме, че нивата на HSP70 в плазмата и черния дроб не са свързани с вида операция SHAM или DJOS; въпреки това те бяха свързани с вида на диетата и взаимодействието между операцията и диетичния режим. Беше забелязано, че животните, които остават на същия тип диета преди и след операция DJOS (CD/CD, HFS/HFS), показват по-ниски концентрации на HSP70 в плазмата и черния дроб в сравнение с групите, при които диетата е променена след операция DJOS ( CD/HFS и HFS/CD). Предполагаме, че промяната в диетата, а оттам и консумацията на различни видове хранителни вещества, е повлияла на биохимичните пътища, причинявайки смущения и нередности в катаболизма на субстрата, което се проявява и при производството на HSP. Независимо от това, за да се потвърди тази теза, трябва да се предоставят допълнителни оценки.

В това изследване бихме предложили също потенциалния ефект на DJOS при намаляване на индукцията на нивата на HSP90. Данните, представени тук, разкриват, че промяната в диетичния режим в комбинация с операцията увеличава HSP90. Най-голямо влияние върху плазмените и чернодробните концентрации на HSP90 има диетата HFS, както след DJOS, така и при SHAM процедури. Въпреки това, процедурата DJOS беше по-малко податлива на това подобрение в сравнение с операцията SHAM.

Тези резултати потвърждават предишни наблюдения, че диетата с висока енергия, високо въглехидрати и мазнини води до значително увеличаване на секрецията на HSP, което може да предизвика инсулинова резистентност чрез инхибиране на Akt фосфорилиране и медиирана от инсулин транслокация на GLUT върху клетъчната мембрана и извънматочно вътреклетъчно натрупване на мазнини с развитие на NAFLD (Angelini et al. 2018).

Заключения

Бариатричните процедури обикновено се използват при лечението на затлъстяване и T2DM. Независимо от това, дълготрайните ефекти на тези процедури зависят от много фактори, сред които диетата е един от най-мощните двигатели. За да се постигне очакваното нормализиране на плазмените и чернодробните концентрации на HSP70 и HSP90, DJOS хирургията трябва да се прилага заедно с подходящ хранителен план. Наличието на HFS диета и промяната на веднъж индуцираните диетични модели водят до повишаване на нивата на HSP70 и HSP90.