Мохамад Абу Басма Радже

Отдел по биология, Училище за дистанционно обучение, Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

hirta

Юет Пинг Куан

1 Институт за изследвания в молекулярната медицина (INFORMM), Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

Zuraini Zakaria

Отдел по биология, Училище за дистанционно обучение, Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

Лахиманан Йога Лата

1 Институт за изследвания в молекулярната медицина (INFORMM), Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

Subramanion L. Jothy

1 Институт за изследвания в молекулярната медицина (INFORMM), Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

Sreenivasan Sasidharan

1 Институт за изследвания в молекулярната медицина (INFORMM), Universiti Sains Malaysia, USM, Pulau Pinang, Малайзия

Резюме

Заден план:

Екстрактът от метанол от Euphorbia hirta L (Euphorbiaceae), който се използва в традиционните лекарства, е тестван за in vivo токсичност.

Материали и методи:

Анализ на леталността на скариди in vivo и проучване за остра токсичност при перорално приложение при единична висока доза от 5000 mg/kg и наблюдение в продължение на 14 дни при мишки са използвани за изследване на токсичния ефект на E. hirta.

Резултати:

Анализът за леталност на саламура се използва за изчисляване на средната летална концентрация (LC50) на метанолни екстракти от E. hirta (за листа, стъбла, цветя и корени) при концентрации от 100 до 0,07 mg/ml. Стойностите на LC50 от 1.589, 1.420, 0.206 и 0.0827 mg/ml са получени съответно за стъбла, листа, цветя и корени. Калиев дихромат (положителната контрола) има LC50 стойност от 0,00758 mg/ml. Проучването за остра орална токсичност на екстракта от листа доведе до една трета смъртност и леки поведенчески промени сред лекуваните мишки. Не са установени значими статистически разлики между телесното тегло, относителното (%) и абсолютното (g) телесно тегло на третирани и нелекувани групи (P> 0,05). Брутното и микроскопско изследване на жизненоважни органни тъкани не разкрива разлики между контролните и лекуваните мишки. Всички тъкани изглеждаха нормални.

Заключения:

Екстрактът от метанол от листата на E. hirta проявява леки токсични ефекти при мишки.

ВЪВЕДЕНИЕ

Растенията отдавна се считат за ценен източник на лекарства за лечение на различни заболявания и заболявания. [1] Повечето, ако не всички хора, са използвали растенията като лечебни средства. Нови оценки показват, че в много развиващи се страни голям брой цивилизации силно зависят от традиционните лекари и лечебни растения, за да отговорят на своите първични здравни нужди. [2,3] Въпреки наличието на съвременна медицина във всички страни, билковите лекарства имат често запазва популярност само по исторически и културни причини. Въпреки това много хора в развитите страни също започнаха да се обръщат към алтернативни или допълващи терапии, включително лечебни растения. [4–6]

Растителните препарати, които са били полезни от медицинска гледна точка, трябва да бъдат нетоксични или с ниска токсичност по отношение на човешките клетки. Следователно е необходимо да се проведат проучвания за токсичност върху лечебни растения, въпреки че те се използват от десетилетия за определяне на приемливи от неприемливи нива на токсичност. В това проучване за първи път оценихме токсичността на отделени части от E. hirta (листа, стъбла, цветя и корени), които по-рано в това проучване проявяваха антибактериални, противогъбични и антиоксидантни действия срещу обикновени човешки патогенни бактерии, Candida albicans и разрушителни свободни радикали. За тази цел е използван биологичният тест за леталност in vitro Artemia salina L. (Artemiidae) nauplii (ларви на саламурени скариди), докато швейцарските мишки-албиноси са използвани за in vivo оценка на острата орална токсичност. Тестовете за остра орална токсичност бяха проведени и при двата пола на мишките, съгласно насоките на Организацията за икономическо сътрудничество и развитие [12] и с одобрението на комисията по етика на животните, Universiti Sains Malaysia.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Растителни материали

Листата, цветята, стъблото и корените на пресните растения са събрани от различни райони в Universiti Sains Malaysia, Penang, Малайзия през юни 2009 г. Таксономичната идентичност на растението е потвърдена от ботаника на Училището по биологични науки в Universiti Sains Malaysia. Растителните материали бяха измити под чешмяна вода и разделени на листа, цветя, стъбла и корени. Отделените части се изсушават на въздух на сянка в продължение на десет дни и след това във фурна при 60 ° C за един до два дни, преди смилане до фин прах с помощта на електрически смесител и се съхраняват в чисти етикетирани херметически затворени бутилки.

Приготвяне на растителния екстракт

Сто грама прах от всяка част се екстрахират чрез накисване в метанол (400 ml) в продължение на 14 дни с често разбъркване. Сместа се филтрира през чиста муселинова кърпа, последвана от двойно филтриране с филтърна хартия Whatman No.1 и филтратът се концентрира чрез ротационно изпаряване под вакуум (вакуум налягане: 500 N/m 2) при 40 ° C до обем от около 15 ml беше достигнато. След това концентратът се изсипва в стъклени чаши на Петри и се довежда до сухо във фурна при 60 ° С. Процентът на добив на суров екстракт се определя за всяка част и е съответно 11,1, 7,3, 4,7 и 4,1% за листа, стъбла, цветя и корени. След това получената пастообразна маса се съхранява в парафилмово запечатани чаши на Петри в тъмен шкаф. Екстрактите се разтварят чрез разтваряне в метанол до необходимите концентрации. Разтворените екстракти се поддържат при 2-8 ° C. Всички екстракти от растителни части бяха използвани за анализ на леталността на саламурените скариди. Само екстракти от листа бяха оценени in vivo.

Тест за леталност на скариди от саламура

Проучване за остра орална токсичност

Животно

Експериментът е проведен върху 12 здрави швейцарски мишки-албиноси (мъже и жени) с тегло от 30 до 35 g и на възраст от 8 до 10 седмици, придобити от Animal House, Universiti Sains Malaysia. Тези мишки бяха разпределени на случаен принцип в две групи, т.е. едната лекувана, а другата контролна група. Всяка група се състоеше от 3 мъже и три жени. Експерименталните процедури, свързани с животните, са разрешени от Етичния комитет на Universiti Sains Malaysia (USM/Animal Ethics Approval/PPSG/07 (A)/044/(2010) (59)) преди започване на проучването и са проведени съгласно международно приетите принципи за лабораторна употреба и грижи за животни.

Тест за токсичност

Хистопатология на жизненоважните органи

Всички жизненоважни органи (сърце, бъбреци, черен дроб, бял дроб и далак), изолирани от всяка отделна мишка, бяха фиксирани в 10% (v/v) формалин, рутинно обработени и вградени в парафинов восък. Парафиновите срезове с дебелина 5.0 μm бяха нарязани с помощта на въртящ се микротом, фиксирани върху стъклени стъкла и оцветени с хематоксилин и еозин за хистологично изследване. Слайдовете бяха изследвани от хистопатолог под (OLYMPUS BX50) сложен светлинен микроскоп, снабден с CCD камера и софтуер за улавяне на изображения. Увеличените изображения на тъканните структури са заснети за по-нататъшен хистопатологичен анализ. [14]

Статистически анализ на органи и телесно тегло

На 15-ия ден бяха оцелени всички оцелели мишки. Жизнено важни органи като сърце, бъбреци, черен дроб, бял дроб и далак са аутопсирани и изследвани макроскопски за наличие на лезии или аномалии. Измерват се и се записват телесното тегло и теглото на органите от контролната и тестовата група. След това се изчислява относителното тегло на организма на всяко животно, както следва. Относително тегло на органи: (абсолютно тегло на органа × 100%)/телесно тегло на мишки в деня на жертвата. [15] Всички отделни органи са наблюдавани макроскопски и външният им вид е сравнен между лекуваната и контролната групи. Статистически анализ за оценка на значителната разлика между двете групи беше проведен чрез провеждане на независим примерен t-тест, използващ приложение за електронни таблици SPSS (версия 16.0). Нивото на значимост, използвано в този анализ, е 5%.

РЕЗУЛТАТИ

Леталност от скариди от саламура

Суровият метанолов екстракт от цветя и корени на E. hirta показа положителен резултат, показващ, че те са биологично активни или токсични. Листата и стъблата имат по-малко токсични ефекти върху науплиите от саламура. Установено е, че леталността е пряко пропорционална на концентрацията на екстракта. 100% смъртност се наблюдава в първите шест епруветки с най-високи концентрации (100, 50, 25, 12,5, 6,25, 3,125 mg/ml) от всички екстракти от растителни части. Концентрациите, които биха могли да убият 50% от А. salina nauplii (LC50), получени от екстракти от листа, стъбла, цветя и корени на E. hirta и тази на положителната контрола, калиев дихромат, са представени в таблица 1. LC50 стойности от 1.589, 1.420, 0.206 и 0.0827 mg/ml са получени съответно от стъбла, листа, цветя и корени. Калиев дихромат имаше LC50 стойност 0,00758 mg/ml. Почти нулева смъртност се забелязва във всички епруветки за отрицателен контрол. Фигура 1 показва стереомикроскопско изображение на мъртъв A. salina nauplii, третиран със суров метанолен екстракт от цветя на E. hirta в продължение на 24 часа. По време на наблюдението не се наблюдава движение в мъртвите придатъци на науплиите.

маса 1

LC50 от метанолов екстракт от части на Euphorbia hirta (стойностите са изразени като средно трикратно)

Стереомикроскопско изображение на Artemia salina nauplus след 24 часа лечение с екстракт от цвете Euphorbia hirta от 100 mg/ml

Проучване за остра орална токсичност

Таблица 2

Потенциални токсични ефекти на екстракт от метанолови листа от Euphorbia hirta при мишки

Таблица 3

Общ външен вид и поведенчески наблюдения за контролни и лекувани групи

Таблица 4

Ефект на екстракт от метанолови листа от Euphorbia hirta върху относителното (%) и абсолютното (g) тегло на органите (n = 3)

Брутно наблюдение на системни органи (черен дроб (A, a), бъбреци (B, b), бели дробове (C, c), сърце (D, d) и далак (E, e) от третирани и екстрактирани мишки)

Хистопатологичен анализ на жизненоважни органи от мишки, третирани с екстракт от листа на Euphorbia hirta при 5000 mg/kg телесно тегло. Главните букви (A-E) означават съответно контрол на черния дроб, белия дроб, сърцето, бъбреците и далака, докато малките букви означават лекуваните. Няма значима патология в тъканите от двете групи

ДИСКУСИЯ

В настоящото проучване ние изяснихме ефектите на остра токсичност на E. hirta върху поведението, индекса на телесното тегло на органи и хистопатологията на черния дроб, далака, белия дроб, сърцето и бъбреците на мишки и A. salina. Съобщава се, че анализът за цитотоксичност на саламурените скариди (A. salina) е ефективен, евтин и сравнително бърз начин за откриване на токсични съединения, изискващи само малки количества проба, т.е. -1) срещу A. salina (наупли от саламура). по отношение на ампицилин трихидрат (LC50 16,87 μg.ml -1). Установено е също, че етаноловият екстракт от листата на E. hirta е мощен молюсцициден срещу охлюв L. acuminate със смъртоносна концентрация от 20 mg/L на 24 h и 17 mg/l на 48 h. [27] В светлината на горепосочените резултати, резултатите от токсичността от животни също ще бъдат необходими като начин за окончателна преценка на безопасността на това растение. До този момент трябва да се внимава, когато се консумира растението.

Острата токсичност обикновено се определя като „неблагоприятната (ите) промяна (и), настъпила (и) непосредствено или за кратко време след еднократен или кратък период на излагане на дадено вещество или вещества или като неблагоприятни ефекти, настъпващи в рамките на кратко време от прилагането на единична доза от веществото или многократни дози, дадени в рамките на 24 часа ”. И неблагоприятният ефект е всеки ефект, който причинява функционално увреждане и/или биохимични лезии, които могат да повлияят на работата на цялото животно или които намаляват способността на органа да реагира на допълнителни предизвикателства. [21] Следователно, химикал, който постъпва в организма по орален път за ограничено време и предизвиква някакъв неблагоприятен ефект с малка латентност, е орално и остро токсичен. Твърди се, че при правилно провеждане и внимателно наблюдение, тестът за остра токсичност може да даде повече информация за биологичните свойства на дадено химично съединение, отколкото всеки друг единичен тест. [28]

В това проучване на остра орална токсичност са използвани 12 швейцарски мишки албиноси от двата пола за наблюдение на токсичните ефекти на суровия екстракт от метанол от листата на E. hirta. И двата пола са използвани за регулаторни цели. Проучванията показват, че мишките дават по-добра прогноза за остра смъртоносна доза при хора в сравнение с плъховете и следователно в това проучване са използвани мишки. [14] Суровият екстракт се прилага орално; по този начин, мишките са гладували преди да приемат дозата, за да се избегне влиянието на храната и други химикали в храносмилателните пътища върху реакцията (реакциите) на съставките на екстракта. Като цяло, пероралното приложение е най-удобният и често използван начин при изследване на остра токсичност. Струва по-малко и е безболезнено за животното. [14] Следователно, няма нужда от използване на анестезия по време на приложението на екстракта. От друга страна, същият път, използван от традиционните лечители при лечението на своите пациенти, е използван и при тестваните животни. Това би направило всички резултати при мишките лесно преводими до очакваните от човека. Всички процедури бяха извършени въз основа на съответните насоки на ОИСР. [12]

E. hirta има дълга история на фолклористично използване при лечението на различни заболявания в почти всяка част на света. Отварата от цъфтящите и плодни растения се използва при лечение на инфекции на дихателните пътища и астма, както и срещу хроничен бронхит, кашлица, белодробни нарушения и при отстраняване на червеи в червата. Инфузия на листа се предписва на кърмачки за увеличаване на лактацията. [29] Тъй като е общоизвестно, че E. hirta се използва за лечение на различни заболявания при хората и освен това не е имало предишни доклади за токсични ефекти на растението, се приема, че е нетоксичен. Следователно при този орален тест за остра токсичност на орално приложение, на изпитваните мишки беше приложено много високо ниво на дозиране от 5000 mg/kg суров екстракт. [12]

В това проучване е установена една трета смъртност при лекуваните мишки. Мъжете са по-чувствителни към екстракта. В това проучване се съобщава за по-малко от 50% смъртни случаи, което предполага, че LD50 е по-висока от 5000 mg/kg. Съгласно следното химическо етикетиране и класификация на острата системна токсичност въз основа на орални LD50 стойности, препоръчани от Организацията за икономическо сътрудничество и развитие: [12] много токсични, 5 50 500 25 μg/ml притежават LD50 между 2500 и 8000 mg /kg.[15] Можем да предположим, че LD50 на остра перорална токсичност за E. hirta оставя метанолов екстракт също ще бъде повече от 2500 mg/kg, тъй като LC50 на теста за леталност на скариди от саламура е 1420 μg/ml.

Ниските стойности на LC50, получени от корените и цветята на растението E. hirta срещу A. salina, могат да подкрепят твърдението, че много от членовете на семейство елави, към които принадлежат тези растения, са отровни за хората и животните. Това отровно свойство се дължи на токсичните съединения, присъстващи в тези растителни части. Поради това трябва да се има предвид вниманието при използването на това растение и е необходима по-нататъшна работа за изолиране и характеризиране на токсичните съединения. От друга страна, биологичният анализ на A. salina вече е показан като добър индикатор за антитуморна активност. Предполага се, че растителният екстракт има голямо разнообразие от биоактивни вещества и може да съдържа съединения, които имат цитотоксични ефекти. Следователно, екстракти, токсични за А. salina, също се предлага да бъдат тествани за токсичност по отношение на човешки туморни клетъчни линии.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

Настоящото ни проучване е ценно, тъй като може да посочи за токсичните части на растението, които могат да помогнат да се използва растението като антимикробно или антиоксидантно средство. Установено е, че екстрактът от метанол от листата на E. hirta е доста нетоксичен, когато се извършва анализ на леталността на скариди от саламура. Докато проучването за остра орална токсичност показва леки токсични ефекти при мишки. Тези резултати могат преди всичко да предполагат, че листата на E. hirta се консумират като антимикробно или антиоксидантно средство в известни дози, особено в бедни селски общности, където конвенционалните лекарства са скъпи и недостъпни. Необходим е обаче подробен експериментален анализ на подострата и хроничната токсичност за по-нататъшна подкрепа на безопасността на този екстракт и са необходими клинични изпитвания, преди да се препоръча за употреба каквото и да е ново фитотерапевтично средство от това растение.

ПРИЗНАВАНИЯ

Авторите признават Ислямската банка за развитие за финансовата подкрепа за извършването на това изследване и специални благодарности на доц. Д-р Гурджи Каур от INFFORM, USM за хистопатологичното изследване на тъканните секции. Yuet Ping Kwan беше подкрепен от стипендия MyPhD от Министерството на висшето образование, правителството на Малайзия, Малайзия.

Бележки под линия

Източник на подкрепа: Нил

Конфликт на интереси: Никой не е деклариран.