Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

глюкоза

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

Ключова лаборатория по ендокринология, Министерство на здравеопазването, Катедра по ендокринология, Болница в Пекинския съюз, Медицински колеж в Пекин, Китайска академия на медицинските науки, Пекин, Китай

  • Цян Джанг,
  • Синхуа Сяо,
  • Минг Ли,
  • Уенхуей Ли,
  • Мяо Ю,
  • Хуабинг Джанг,
  • Жиксин Уанг,
  • Хонгдинг Сян

Корекция

21 януари 2014 г .: Zhang Q, Xiao X, Li M, Li W, Yu M, et al. (2014) Корекция: Акарбозата намалява кръвната глюкоза чрез активиране на miR-10a-5p и miR-664 при диабетични плъхове. PLOS ONE 9 (1): 10.1371/анотация/330eea00-9c09-4982-a458-3add994bab9d. https://doi.org/10.1371/annotation/330eea00-9c09-4982-a458-3add994bab9d Преглед на корекцията

Фигури

Резюме

Цитат: Zhang Q, Xiao X, Li M, Li W, Yu M, Zhang H, et al. (2013) Акарбозата намалява кръвната глюкоза чрез активиране на miR-10a-5p и miR-664 при диабетични плъхове. PLoS ONE 8 (11): e79697. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0079697

Редактор: Рашид Ахмад, Институт по диабет Dasman, Кувейт

Получено: 2 юли 2013 г .; Прието: 4 октомври 2013 г .; Публикувано: 18 ноември 2013 г.

Финансиране: Тази работа е финансирана от Националната природонаучна фондация на Китай (№ 81170736), Националната природонаучна фондация за млади учени на Китай (№ 81300649) и Националната ключова програма за клинична наука и Пекинския медицински колеж. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Захарният диабет е едно от най-често срещаните хронични заболявания в световен мащаб и продължава да нараства честотата и значимостта, тъй като промяната на начина на живот води до намалена физическа активност и повишено затлъстяване. Захарният диабет тип 2 е възникващ здравен проблем в световен мащаб, като броят на глобалните случаи на диабет тип 2 се очаква да се удвои до 350 милиона до 2030 г. [1]. Диабетът е независим рисков фактор за сърдечно-съдови заболявания [2], [3] и е водещата причина за заболеваемост и смъртност в развития свят [4] - [6].

Акарбозата е инхибитор на α-глюкозидазата, който забавя усвояването на сложни въглехидрати и дизахариди до резорбируеми монозахариди чрез обратимо инхибиране на α-глюкозидазите в границата на чревната четка, като по този начин отслабва пиковете на кръвната захар след хранене [7]. Клиничните изпитвания демонстрират, че акарбозата обикновено подобрява гликемичния контрол при пациенти със захарен диабет, който може да се управлява само чрез диета или в комбинация с други антидиабетни терапии, както се доказва от намалена постпрандиална плазмена глюкоза и гликозилиран хемоглобин. Изглежда, че не променя пряко инсулиновата резистентност, но може да понижи нивата на инсулин след плазмата. Бионаличността на акарбозата обаче е ниска [8], което се дължи на лошата й разтворимост във вода.

МикроРНК (miRNAs) са къси (21–23 нуклеотида), ендогенни, некодиращи РНК молекули. miRNAs регулират генната експресия чрез несъвършено сдвояване на база с 3′-нетранслираните области на mRNAs, което води до разпадане на mRNA или транслационна репресия [9]. miRNAs имат различни пространствени и времеви модели на експресия в клетките и тъканите и регулират няколко процеса, включително хематопоеза, развитие, клетъчна диференциация, пролиферация и апоптоза [10], [11]. Те са замесени в няколко заболявания, включително диабет.

Затова предположихме, че акарбозата директно променя чревната експресия на miRNAs, за да регулира метаболизма на глюкозата. За да предоставим молекулярни доказателства за този механизъм, използвахме модел на плъх на диабет тип 2, за да изследваме диференциалната експресия на miRNA в червата на плъхове след лечение с акарбоза.

Материали и методи

1. Животински модели, групиране и лечение

2. Измерване на телесно тегло и кръвна глюкоза на гладно

Теглото на тялото се измерва на всеки 2 седмици. 6-часовото ниво на кръвната захар на гладно (FBG) се измерва на всеки 2 седмици с помощта на глюкомер Contour TS (Bayer) с кръв от кръвоизлив от опашката.

3. Тест за орална толерантност към глюкоза (OGTT)

След като плъховете гладуват в продължение на 6 часа, се прилагат перорално 2,2 g/kg глюкоза. След това, кръвни проби се събират от вените на опашката при 0 (преди натоварването с глюкоза), 30, 60 и 120 минути (след натоварването с глюкоза) за глюкозен анализ. Площта под кривата (AUC) е изчислена за кръвна глюкоза (BG) по време на OGTT: AUC = 0,5 × (BG0 + BG30)/2 + (BG30 + BG60)/2 + 1 × (BG60 + BG120)/2.

4. Анализ на нивата на серумен IL6 и TNF-α

На седмица 8, кръвни проби се събират след евтаназия и се центрофугират при 1000 g в продължение на 10 минути. Серумът се съхранява в аликвотни части при -80 ° C, за да се анализира серумен интерлевкин 6 (IL6) и тумор некрозис фактор α (TNF-α). Нивата на серумен IL6 и TNF-α бяха измерени чрез ензимно-свързан имуносорбентен анализ (ELISA, Abcam, UK).

5. miRCURY LNA ™ микроРНК масив Експеримент

Системата miRCURY LNA ™ miRNA съдържа 3100 сонди за улавяне, обхващащи всички микроРНК на плъхове (388 miРНК), които са анотирани в miRBase 18.0, както и всички вирусни микроРНК, свързани с плъхове. Общата РНК от илиема на AcarH групата и DM групата е събрана с помощта на TRIzol (Invitrogen) и miRNeasy Mini Kit (QIAGEN) съгласно инструкциите на производителите. След като РНК беше количествено определена с помощта на NanoDrop 1000, пробите бяха етикетирани с помощта на комплект за маркиране на miRCURY ™ Hy3 ™/Hy5 ™ Power и хибридизирани върху miRCURY ™ LNA Array v.18.0 (Exiqon). След измиване слайдовете бяха сканирани с помощта на скенер за микрочипове Axon GenePix 4000B.

6. Анализ на данни от генни масиви

Нормализирането беше извършено с метод на 50-ти персентил за чип, който нормализира всеки чип по неговата медиана, което позволява сравнение между чиповете.

7. miRNA Target Gen Prediction

МиРНК целевите гени бяха идентифицирани с помощта на онлайн базата данни miRWalk (http://www.umm.umi-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk/). miRWalk предоставя информация за публикувани цели на пътя от Киото енциклопедията на гените и геномите (KEGG, http://www.genome.jp/kegg/). Генните функции са получени от NCBI-Gene (http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

8. количествена количествена PCR в реално време (qRT-PCR)

Общата РНК (5 ng) беше обратно транскрибирана с помощта на комплект за обратна транскрипция Taqman ™ MicroRNA (Applied Biosystems) и специфичните за miRNA праймери за обратна транскрипция, предоставени с TaqMan ™ MicroRNA Assays (Applied Biosystems). За обратна транскрипция се използва PTC-225 Peltier Thermal Cycler (MJ Research Inc., Waltham, Massachusetts). Реакционните условия бяха 16 ° С за 30 минути, 42 ° С за 30 минути и 85 ° С за 5 минути. Генерираната miRNA-специфична cDNA се амплифицира с помощта на TaqMan ™ Universal PCR master mix II (Applied Biosystems) и съответната специфична сонда, предоставена с TaqMan ™ Small RNA Assays (Applied Biosystems). PCR се извършва с помощта на система за откриване CFX-96TOUCH (Bio-Rad). Усилването се извършва при 95 ° С за 10 минути, последвано от 40 цикъла от 95 ° С за 15 секунди и 60 ° С за 60 секунди. U6 малка ядрена РНК се използва като ендогенен контрол. Промяната на гънките в нивото на miRNA се изчислява по уравнението: промяна на гънките = 2 - △△ Ct, където △ Ct = CtmiRNA-CtU6 и △△ Ct = treated проби, третирани с каркарбоза - △ проби с диабет без лечение [14].

9. Валидиране на целеви ген чрез qRT-PCR

За валидиране на целеви гени на miRNA, бяха извършени qRT-PCR анализи на РНК, използвайки SYBR Green. Всеки qRT-PCR анализ се повтаря с използване на три биологични повторения и всеки анализ се състои от три технически повторения. Преди PCR анализ, всяка проба от обща РНК се третира с DNK без RNase (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ). РНК се транскрибира обратно чрез Superscript II (Invitrogen, Калифорния, САЩ). Грундовете са проектирани с помощта на софтуера за проектиране Primer Express ™ на Applied Biosystems (Foster City, CA, USA). Грундовете са закупени от Applied Biosystems (Таблица 1). Използвайки системата за откриване на последователност ABI Prism 7700, бяха използвани следните условия на реакция: първоначална денатурация при 48 ° C за 30 минути, последвана от 95 ° C за 15 минути и след това 40 цикъла от 95 ° C за 15 секунди и 55 ° C за 1 мин. И окончателно неограничено задържане от 4 ° C. Последователностите на праймерите са изброени в Таблица 1. За нормализиране е използван сигналът на домакинския ген Gapdh (глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа). Относителното количествено определяне на иРНК между третираните с акарбоза групи и DM плъховете беше изчислено, използвайки сравнителния Ct метод.

10. Имунохистохимично оцветяване

Данните представляват средна стойност ± SD (n = 10 на група). ** P # P Фигура 2. Ефектът на акарбозата върху пероралния глюкозен толеранс тест за кръвна глюкоза (A) и AUC (B) при плъхове.

Данните представляват средна стойност ± SD (n = 10 на група). ** P # P Фигура 3. Ефект на акарбозата върху серумния IL6 (A) и TNF-α (B) при плъхове (n = 10 на група).

Данните представляват средна стойност ± SD (n = 10). ** P ## P 2, P 2, P Фигура 4. Графиката на вулкановия график на масива miRNA.

Тази графика показва, че log 2 на промяната на гънките във всеки израз на miRNA между AcarH групата и DM групата е в сравнение с нейния -log 10 на P стойност от t-теста. Вертикалната зелена линия показва, че промяната в сгъването на прага на експресия на miRNA е 2. Хоризонталната зелена линия показва, че P стойността на прага на t-теста е 0,05. Имаше 8 miRNAs, които показаха значително различна експресия между AcarH групата и DM групата.

7. Идентифициране на целевите гени на диференциално експресираните miRNAs с помощта на биоинформатичен анализ

След това извършихме биоинформатичен анализ, за ​​да идентифицираме целевите гени на диференциално експресираните miRNAs. Заедно осемте miRNAs имаха 189 валидирани целеви гена в базата данни miRWalk (Таблица 3). Чрез използване на базата данни miRWalk и KEGG тези 189 валидирани гена са замесени в сигналния път на TGF-β, сигналния път на MAPK, сигналния път на Wnt и са включени във взаимодействието на цитокин-цитокин рецептор (Таблица 4).

8. иРНК qRT-PCR

За да се определи дали локалната генна експресия на възпалителни маркери в илеума е променена чрез лечение с акарбоза, експресията на иРНК на IL6, Mapk1 и TNF се определя чрез qRT-PCR. Експресията на Il6, Mapk1 и Tnf беше регулирана надолу значително в групата на AcarH (P Таблица 5. Сгъваема промяна на AcarH спрямо DM в генната експресия, измерена чрез Q-RT-PCR.

9. Имунохистохимично оцветяване

За да се потвърди, че протеиновата експресия на възпалителни маркери е променена в илеума на DM плъхове, третирани с акарбоза, са проведени имунохистохимични анализи за TNF-a, IL6 и MAPK1 върху тъканите на илеума. В групата на AcarH е налице статистически значимо намаляване на имунореактивността на TNF-α, IL-6 и MAPK1 (Фигура 6).