Син Чен

1 ключова лаборатория по традиционна китайска медицина и химия на традиционната китайска медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

анти-хеликобактер

Лиджуан Ху

1 ключова лаборатория по традиционна китайска медицина и химия на традиционната китайска медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

Хуанхуан Ву

1 ключова лаборатория по традиционна китайска медицина и химия на традиционната китайска медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

Вей Лю

1 ключова лаборатория по традиционна китайска медицина и химия на традиционната китайска медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

Шухе Чен

2 Провинциална болница по традиционна китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

Айджун Джоу

3 Донгуанска болница по традиционна китайска медицина, Дунгуан 523000, Китай

Янвен Лиу

1 ключова лаборатория по традиционна китайска медицина и химия на традиционната китайска медицина, Университет по китайска медицина Хубей, Ухан 430060, Китай

Резюме

1. Въведение

Хроничният гастрит и стомашната язва са много разпространени заболявания на храносмилателния тракт през всички възрасти в света и се считат за глобален здравен проблем [1]. Обикновено те водят до дисбаланс между защитните фактори и агресивните фактори в стомашната лигавица [2]. Освен това те могат да бъдат предизвикани от редица фактори, като инфекция с хеликобактер пилори (H. pylori) [3], алкохол, стрес и продължителна употреба на нестероидни противовъзпалителни лекарства (например аспирин, ибупрофен и напроксен) [4]. Ранното диагностициране и лечение може да подобри благосъстоянието на пациентите и да намали крайния риск от рак на стомаха; следователно ранната диагностика на инфекция с H. pylori е от решаващо значение [5]. Досега хроничният гастрит и стомашната язва остават слабо разбрана субект, без текущи ефективни фармакологични стратегии за лечение на хроничен гастрит и свързаните с него диспептични симптоми [6]. Хроничното възпаление играе важна роля в развитието на различни видове рак, особено в храносмилателните органи, включително рак на стомаха, свързан с H. pylori [7].

Инфекцията с H. pylori е най-честата причина за хронично възпаление на стомаха в световен мащаб [8]. Бактерията, открита от Уорън и Маршал през 1982 г., колонизира около половината от световното население. Всички инфектирани с H. pylori индивиди могат да развият хроничен гастрит [7–10]. H. pylori има широко разпространение в световен мащаб, особено в развиващите се страни [11]. Въпреки високото разпространение на инфекцията с H. pylori, се изчислява, че 1% от заразените хора ще развият некардиен рак на стомаха [12]. Въпреки че пероралното приложение на антибактериални средства, като амоксицилин, кларитромицин и метронидазол, се извършва по целия свят за лечение на пациенти, заразени с H. pylori, устойчивостта срещу тези антибактериални агенти се увеличава всяка година [13, 14]. В резултат на това възникна голяма нужда от откриване и разработване на нови анти-Н. pylori лекарства, особено от билки, които не само ще унищожат и евентуално ще предотвратят организма, но и ще имат минимални странични ефекти, ще бъдат лесно достъпни и достъпни дори за бедните.

Xiaochaihutang (XCHT), класическа китайска билкова рецепта, е записана за първи път в „Shanghan Lun“ преди две хиляди години [15, 16]. Състои се от седем обичайни китайски билки: Chaihu (Radix Bupleuri), Huangqin (Radix Scutellariae), Renshen (женшен), Banxia (Pinellia tuber), Radix Glycyrrhizae (семейство: Leguminosae; латинско наименование: Glycyrrhiza uralensis Fisch.), Gancao Glycyrrhizae), Shengjiang (Rhizoma Zingiberis Recens) и Dazao (Fructus Jujubae). Radix Bupleuri е основната активна съставка на XCHT и е широко използван за лечение на различни възпалителни разстройства като хроничен хепатит [17], бронхит, обикновена настинка, пневмонит, ентерогастрит [18] и депресивни разстройства в Китай [ 19, 20].

В нашето изследване тази класическа рецепта е подобрена от повече от десет години клиничен опит в южните градове на Китай с характер с висока ефективност, ниска честота на повтаряне, нисък страничен ефект и ниска цена. В тази модифицирана рецепта Renshen (женшен) е заменен от Dangshen (Radix Codonopsis) за намаляване на разходите; освен това, други четири билки chinense, Huanglian (Rhizoma Coptidis), Ganjiang (Rhizoma Zingiberis), Fuling (Poria) и Baizhu (Rhizoma Atractylodis Macrocephalae), бяха добавени за функциите на вятър студ/топлина с двойно предназначение, остри лекарства за дисперсия и горчиви лекарства за пречистване и тонизиране и прочистване в комбинация и създадени модифицирани Xiaochaihutang (MXCHT).

Тази рецепта се използва за лечение на хроничен гастрит и стомашна язва от инфекция с H. pylori с висока степен на излекуване, причинена от нередовни навици на живот и забързана работна среда. Доколкото ни е известно, не са предоставени научни доказателства за лечение на хроничен гастрит и стомашна язва както на класическия XCHT, така и на MXCHT. Затова проведохме това проучване, за да потвърдим ефикасността на MXCHT за хронично възпаление на стомаха и да изследваме неговите активни съставки. Нашето проучване е първото, което изследва ефективния екстракт за анти-Н. pylori и противовъзпалителен ефект на MXCHT и след това се идентифицират основните съставки след перорално приложение на активен екстракт чрез HPLC-TOF-MS/MS метод. Нашите открития не само изясняват in vitro анти-Н. pylori и противовъзпалителни ефекти на MXCHT, но също така частично разкриват основните активни компоненти в кръвта. Предполагаме, че MXCHT е потенциално ефективен терапевтичен подход за лечение на хроничен гастрит и стомашна язва от инфекция с H. pylori.

2. Материали и методи

2.1. Материали и реактиви

MXCHT е съставен от 15 g Radix Bupleuri (семейство: Umbelliferae; латинско име: Bupleurum chinense DC), 10 g Radix Scutellariae (семейство: Labiatae; латинско наименование: Scutellaria baicalensis Georgi), 10 g от Rhizoma Pinelliae [семейство: Araceae; Латинско наименование: Pinellia ternata (Thunb.) Breit.], 10 g от Radix Codonopsis [Семейство: Campanulaceae; Латинско наименование: Codonopsis pilosula (Franch.) Nannf.], 6 g Radix Glycyrrhizae (семейство: Leguminosae; латинско наименование: Glycyrrhiza uralensis Fisch.), 30 g Fructus Jujubae (семейство: Rhamnaceae; латинско име: Ziziphus jujuba Mill., 10 g от Rhizoma Zingiberis Recens (семейство: Zingiberaceae; латинско име: Zingiber officinale Rosc.), 6 g от Rhizoma Zingiberis (семейство: Zingiberaceae; латинско наименование: Zingiber officinale Rosc.), 3 g от Rhizoma Coptida (семейство: Ranuncute) Латинско наименование: Coptis chinensis Franch.), 15 g Poria [семейство: Polyporaceae; Латинско наименование: Poria cocos (Schw.) Wolf] и 10 g от Rhizoma Atractylodis Macrocephalae (семейство: Compositae; латинско наименование: Atractylodes macrocephala Koidz). Суровите лекарства са закупени от Jiuzhoutong Chinese Pharmaceutical Co. Ltd. (Ухан, Китай) и са удостоверени от професор Кели Чен (Фармацевтичен факултет, Университет по китайска медицина Хубей, Китай). Образци на ваучери са депозирани в хербариума на Китайския университет на Хубей.

Baicalin (110715-201318), Liquiritin (111610-201106) и Saikosaponin A (110777-201309) бяха от Националните институти за контрол на храните и лекарствата. Baicalein (PS1405-1604) и амониевата сол на глициризинова киселина (PS0061-0020) са от Push Bio-Technology Company (Ченгду, Китай). Кларитромицин и аспирин, използвани като положителни контроли, са получени съответно от Pharmacy Yabang (Jiangsu, China) и Original Pharmacy (Shenyang, China); нормален физиологичен разтвор е получен от Double-Crane Pharmacy (Пекин, Китай); λ-карагенанът е закупен от компания Sigma; химически реактиви са закупени от China National Pharmaceutical Group Corporation.

2.2. Приготвяне на различен екстракт от MXCHT

Екстракти от MXCHT се приготвят по три процедури. Една процедура е дестилация с пара, която се използва за получаване на летливо масло; втората е екстракция с вода, която се извършва чрез мацериране на няколко изсушени билкови смеси в дестилирана вода за 1 h и след това кипене три пъти (100 g/1200 ml за първи път; 100 g/1000 ml за втори път; 100 g/800 mL трети път) за 1,5 часа всеки път; третият е звукова екстракция (метанол: НС1 = 100: 1, три пъти, 0,5 часа). След разделяне с различни органични реагенти по метода на системния разтворител, базиран или на полярността, или на структурните свойства на съставките, са получени пет различни екстракта, включително летливо масло (0,15%, тегл.), Воден екстракт (13,3%, т/т), CHCl3 екстракт (0,58%, тегл./Тегл.), EtOAc екстракт (1,17%, тегл./Тегл.) И n-BuOH екстракт (3,61%, тегл./Тегл.). Екстрактът от метанол от Rhizoma Coptidis се смесва с екстракт от CHCl3, поради берберинови съединения.

2.3. Изпитване за чувствителност

Чувствителността на H. pylori до пет екстракта се определя чрез дифузионната техника на агаровата чашка. Щамът H. pylori (ATCC43504, Beinuo Life Science, Шанхай) е отгледан върху агар от Колумбия, допълнен с 5% стерилна дефибринирана овча кръв при 37 ° C за 72 h при микроаерофилни условия (5% O2, 10% CO2 и 85% N2) и 98% влажност. Суспензията ATCC43504 се разрежда с нормален физиологичен разтвор. Кларитромицин е включен като положителна контрола, докато чист разтворител без тествани съединения е използван като отрицателна контрола.

Пълната рецепта и водният екстракт се разреждат в 10 ml дестилирана вода; останалите четири екстракта се приготвят чрез 10 ml разтворени в 1% (обем/обем) Tween-80% и дестилирана вода. Като предпазна мярка да не се пропуснат следи от антимикробни средства, за предварителен скрининг беше приготвена относително висока концентрация на всеки екстракт за тест с по-ниска концентрация за пълно предписание. Чистият кларитромицин се разтваря в 15 ml дестилирана вода, за да се получи концентрация от 16,67 mg/ml.

Антимикробният скрининг се извършва по метода на дифузия на агар [21]. 15 ml разтопен агар от Колумбия при 50 ° C, допълнен с 5% стерилна дефибринирана овча кръв, се посява с 1 ml 1: 100 разреждания от прясна култура за цяла нощ от суспензия ATCC43504 (приблизително 1 × 105 cfu/ml) и се смесва старателно . Сместа се изсипва асептично в чашките на Петри и се оставя да стегне. Оксфордска купа HB-four е използвана за направата на равноотдалечени кладенци в засетия агар. 100 μL от възстановените екстракти се поставят в ямките. Положителната контрола върху лекарството и отрицателната контрола бяха поставени по равно в съответните ямки. Инокулираните плаки се инкубират при 37 ° С в инкубатор при микроаерофилни условия (5% O2, 10% CO2 и 85% N2) в продължение на 3 дни, след което се измерват диаметрите на зоните на инхибиране (mm). Всеки експеримент се повтаря три пъти, за да се осигури точност и се изчислява средната стойност на диаметъра на зоните на инхибиране. Контролът включваше използване на разтворител без тестов екстракт, въпреки че не беше отбелязана антибактериална активност в разтворителя, използван за теста.

2.4. Определяне на минималната инхибираща концентрация (MIC)

MIC се определя, като се използва метод за разреждане на агар, както е описано по-горе [21]. Различни екстракти се разреждат с културна среда от агари Columbia, за да се получат поредица от изходни разтвори при определени концентрации. 1 ml от тези разтвори и 50 μL прясна суспензия ATCC43504 (приблизително 1 × 10 7 cfu/ml) бяха добавени към 2 ml епруветка. Положителен контрол беше приготвен с 1 ml хранителна среда и 50 μL прясна суспензия ATCC43504 (приблизително 1 × 10 7 cfu/ml); се приготвя отрицателна контрола с 2 ml хранителна среда. След това всички епруветки се инкубират при 37 ° С в продължение на 72 часа при микроаерофилни условия. MIC се определя като най-ниската концентрация на антибиотиците, при която растежът на инокулата е напълно инхибиран. Всички тестове бяха извършени в два екземпляра.

2.5. Животни

Мишки Kunming с тегло (18–22 g) и мъжки мишки Wistar с тегло (190–210 g) са предоставени от Експерименталния център за животни от провинция Хубей. Животните се поддържат в стандартизирани условия на околната среда (22 ± 2 ° C, 12 часа цикъл светлина/тъмнина) със свободен достъп до храна и вода и се настаняват по шест на клетка. Всички експерименти са проведени съгласно Правилника за експериментална администрация с животни, издаден от Държавния комитет по наука и технологии на Китай.

2.6. Модел на оток на ушите на мишка, предизвикан от ксилол

За да се оцени противовъзпалителният ефект на пълната рецепта и пет екстракта, индуциран от ксилол модел на оток на миши уши беше индуциран с локално приложение на 20 μL разтворител ксилен, описан по-рано [22, 23]. Малко след това 112 мишки Kunming (18–22 g) бяха разделени на случаен принцип в 14 групи от по осем и всяка мишка беше лекувана с перорално приложение в продължение на 6 дни, както следва: Група 1 получи 0.9% физиологичен разтвор; Група 2 получи 50 mg аспирин на kg като положителна контрола; Групи 3 и 4 получават съответно еднократна и двукратна клинична доза пълна рецепта на kg телесно тегло; Групи 5–14 получават съответно една и четири пъти клинична доза от всеки екстракт на кг телесно тегло. Отокът се индуцира чрез прилагане на 20 μL ксилол върху вътрешната и външната повърхност на дясното ухо. Лявото ухо се счита за контрол. След прилагане на ксилол в продължение на 45 минути, мишките бяха умъртвени под етерна анестезия и двете уши бяха отстранени и претеглени.

2.7. Модел на оток на лапата, предизвикан от карагенан

За да се оцени антиноцицептивният ефект на пълната рецепта и пет екстракта, индуциран от карагенан модел на оток на лапи на мишки беше индуциран с локално приложение на 1% (v/v) карагенан (100 μL), описан по-рано [24]. Накратко, 112 мъжки плъхове Wistar (190–210 g) бяха разделени на случаен принцип в 14 групи от по осем и всяка мишка беше лекувана с перорално приложение в продължение на 6 дни, както следва: Група 1 получава 0.9% физиологичен разтвор; Група 2 получи 75 mg аспирин на kg като положителна контрола; Групи 3 и 4 получават съответно еднократна и двукратна клинична доза пълна рецепта на kg телесно тегло; Групи 5–14 получават съответно една и четири пъти клинична доза екстракт на кг телесно тегло. 100 μL 1% суспензия карагенан в нормален физиологичен разтвор се инжектира в плантарната страна на дясната задна лапа на всеки плъх след перорално приложение на тестови проби за 1 h. Обемът на лапата се измерва с плетизмометър на 1, 2, 3, 4 и 5 часа след инжектиране на карагенан. Степента на подуване се оценява от делта обема (a - b), където a и b са обемът на дясната задна лапа след и преди лечението с карагенан, съответно.

2.8. Индуцирана от етанол язва

Плъховете бяха разделени на групи от осем животни, всяка предварително обработена с носител (Veh: вода плюс 1% твин, 1 mL/kg, перорално), ранитидин (Cbn: 0,04 g/kg, перорално), MXCHT (16,5 и 33 g/kg, по) или група за ефективни екстракти (0,75 и 1,5 g/kg, по) 7 дни преди получаване на 0,2 ml етанол PA (0,5 ml/100 g), за да се предизвика стомашна язва. След 1 h от приложението на етанол животните бяха евтаназирани. След това се разглежда сплескан стомах и ивиците на лезиите му се измерват с дебеломер Vernier, за да се оцени лезията на стомашната лигавица, както следва: дължината на ивицата се записва като оценка на лезията и резултатът се удвоява, ако ширината на ивицата е над 1 mm [25] . Средният резултат за лезия за всяка група се изразява като индекс на лезия и степента на инхибиране на лезията се изчислява по следната формула:

2.9. Подготовка на плазмените проби

След окончателно приложение на екстракти (1,5 ml/100 g) с 0,5 h, кръвни проби от 6 мъжки мишки Wistar като празна и дозова група бяха събрани от суборбиталната вена в хепаринизирани епруветки и центрофугирани при 3500 rpm в продължение на 10 минути. Супернатантата беше получена и съхранена при -20 ° С. Всички плазмени проби от три мишки на група се комбинират в една проба, така че да се елиминира индивидуалната вариабилност. 1 ml плазмена проба се екстрахира с утаяване на протеин с 3 ml ацетонитрил. След центрофугиране при 12000 оборота в минута в продължение на 10 минути, супернатантата се изпарява до сухо под лек поток азот под 40 ° С. След това остатъкът се разтваря с 200 μL метанол; 0.6 μL супернатант се инжектира в HPLC-TOF-MS/MS система за анализ. Освен това пробата от празна кръв се обработва по същия начин.

2.10. Анализ на MXCHT чрез HPLC-TOF-MS/MS система

За класическия Xiaochaihutang (XCHT) бяха идентифицирани 44 компонента, включително Saikosaponin, ginsenoside, Baicalin и Liquiritin, използвайки метода HPLC-MS/MS, описан в предишни доклади [26, 27]. В това изследване се използва HPLC-TOF-MS/MS за идентифициране на химичните съставки на двата активни екстракта на MXCHT, екстракт EtOAc и екстракт n-BuOH. Системата HPLC-TOF-MS/MS се състои от система за високоефективна течна хроматография (HPLC) Agilent 1260 Infinity, свързана с масспектрометър Agilent 6530 Q-TOF (Agilent Corporation, САЩ). Данните бяха получени и обработени с помощта на софтуера за качествен анализ Agilent MassHunter B.07.00.

Хроматографското разделяне се извършва на Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 RRHD (50 × 2.1 mm, i.d., 1.8 μm) с температура на колоната, поддържана на 30 ° C, и дължината на вълната на откриване е 275 nm. Подвижната фаза на градиента се състои от ацетонитрил (а) и 0,1% мравчена киселина във вода (b) при скорост на потока от 0,4 ml/min. Програмата за градиентно елуиране е показана в Таблица 1. MS анализът е извършен от електроспрей източник, работещ както в положителни, така и в отрицателни йонни режими, като условията на масата са както следва: напрежението на конуса е 25 V, а капилярното напрежение е 3.0 KV в режим на положителен йон и 3.0 KV в режим на отрицателни йони. За разтварянето се използва азот и конусен газ със скорост на потока 8 L/min при температура 320 ° C и температура на източника 120 ° C. Сблъскващият газ е аргон. MS данните бяха събрани в режим на пълно сканиране от m/z 100 до 1000 amu.

маса 1

Програма за градиентно елуиране на HPLC-TOF-MS/MS метод.