Yong He, Jody Manischewitz, Clement A. Meseda, Michael Merchlinsky, Russell A. Vassell, Lev Sirota, Ira Berkower, Hana Golding, Carol D. Weiss, Антитела към протеина A27 на вируса на ваксиния неутрализират и предпазват от инфекция, но представляват незначителна Компонент на имунитет, предизвикан от ваксина срещу Dryvax, Вестник за инфекциозни болести, том 196, брой 7, 1 октомври 2007 г., страници 1026–1032, https://doi.org/10.1086/520936

неутрализират

Резюме

Ваксината против едра шарка Dryvax, която се състои от реплициращ се ваксиничен вирус, предизвиква антитела, които играят важна роля в защитата. Няколко протеини от ваксиния генерират неутрализиращи антитела, но тяхното значение за защита е неизвестно. Изследвахме ефикасността на антителата към протеина A27 на зрелия вирион в експерименти за неутрализация и защита и приноса на антитела A27 към индуцирания от Dryvax имунитет. Използвайки рекомбинантен A27 протеин (rA27), потвърдихме, че A27 съдържа неутрализиращи детерминанти и че имуноглобулинът от ваксиния (VIG), получен от реципиенти на Dryvax, съдържа реактивност към A27. Въпреки това, VIG неутрализацията не беше значително намалена, когато A27 антителата бяха премахнати, а антителата, предизвикани от rA27, подобриха защитата, предоставена от VIG в експерименти за пасивен трансфер. Тези открития демонстрират, че антителата A27 не представляват основната част от неутрализиращата активност във VIG и предполагат, че имунитетът може да бъде увеличен от ваксини и имунни глобулини, които включват силни отговори на антитела срещу A27.

Заплахата от биотероризъм стимулира нови инициативи за ваксина срещу едра шарка. Въпреки че лицензираната от САЩ ваксина срещу едра шарка Dryvax (Wyeth Laboratories), съставена от реплициращ ваксиничен ваксиничен вирус (VACV), е високо ефективна, тя създава риск за безопасността, особено за имунокомпрометирани лица. Разработват се ваксини с подобрени профили на безопасност [1, 2], но при липса на огнище на вирус на ортопокса оценките на ефикасността трябва да зависят от човешкия имунен отговор и експериментите за защита при животински модели [3].

Тук оценяваме антитела A27, предизвикани от Dryvax, и допълнително изследваме потенциала на rA27 да индуцира защитни антитела. Ние потвърждаваме, че rA27 предизвиква силни неутрализиращи антитела и допълнително показват, че антителата срещу rA27 осигуряват частична защита и увеличават VIG при имунокомпрометирани мишки. Освен това показваме, че Dryvax индуцира анти-A27 неутрализиращи антитела, но че те представляват само малка част от общата неутрализираща активност във VIG. Тези открития демонстрират потенциала за повишаване на имунитета срещу поксвируси чрез подходи, които предизвикват силни хуморални реакции на A27.

МАТЕРИАЛИ И МЕТОДИ

Вируси и клетки. Щамове VACV Western Reserve (VACV-WR; ATCC VR-1354) и vSC56 [27], експресиращи β-галактозидаза и липсващи функционални TK гени (предоставени от B. Moss, National Institutes of Health, Bethesda, MD) бяха разпространени и титрирани в BS- C-1 клетки и пречистени чрез центрофугиране с градиент на захароза [28].

Антитела и имунизации. VIG, търговски имуноглобулинов препарат от имунизирани с Dryvax лица, беше предоставен от д-р Дороти Скот (Американска администрация по храните и лекарствата, Роквил, MD). Два до шест новозеландски бели зайци се грундират подкожно с 200 µg rA27 или неконюгиран, пречистен пептид, смесен с пълния адювант на Freund, последван от 2–4 ускорения от 100 mg антиген, смесен с непълния адювант на Freund, на интервали от 4 седмици. Серумните проби се нагряват до 56 ° С в продължение на 30 минути, за да се инактивира комплемента. Контролните имунни глобулини, използващи неподходящ HIV антиген, се приготвят по подобен начин.

ИФА. За ELISAs, 96-ямкови полистиролови плаки (Corning) бяха покрити с rA27 или пептиди (75 pmol) в PBS за една нощ, измити с Tris-буфериран физиологичен разтвор с 0,5% Tween 20 (TBS-T) и блокирани с 5% обезмаслено сухо мляко в TBS-T. Серийните разреждания на серума или имунните глобулини (IgG) се инкубират за 1 h при 37 ° C и се промиват 4 пъти в TBS-T преди 1 h инкубация с конюгирано с пероксидаза анти заешко или античовешко антитяло (Roche Diagnostics), разредено 1: 5000. След прилагане на разтворим 3,3 ′, 5,5′-тетраметилбензидин (BM Blue, POD субстрат; Roche Diagnostics) в продължение на 30 минути, пробите бяха отчетени за абсорбция (оптична плътност при 450 nm). Крайната точка на серумния титър (или милиграми на свързваща единица за IgG) е определена като най-високото серумно разреждане (или най-малкото количество антитяло), което води до абсорбция> 3 SDs над тази на отрицателното контролно антитяло при най-ниското разреждане.

Анализ за неутрализация. Неутрализационните титри се определят чрез инкубиране на серумни или IgG разреждания в модифицираната среда на Dulbecco Eagle с 10% фетален телешки серум с VACVWR при тестове за неутрализация на плака (PRNT) [28]. Накратко, 0,5 ml VACV, съдържащи 100–300 pfu, бяха инкубирани с серийни разреждания на антитела в продължение на 30 минути при 37 ° C преди инокулиране на BS-C-1 монослоеве в 12-ямкови плаки за 1 h при 37 ° C, последвано от 2 измивания с PBS и култивиране в продължение на 2 дни при 37 ° C под течно покритие. Плаките се преброяват след оцветяване с 0,1% кристално виолетова. Неутрализиращият титър се определя като серумно разреждане или количество IgG (в милиграми), необходимо за намаляване на броя на плаките в ямка с 50% (Nt50).

Отмяна на неутрализацията. Неутрализиращите антитела в количество, близко до IC50, се смесват в присъствието или отсъствието на посочените концентрации на rA27 в продължение на 30 минути преди инкубиране с вирус за PRNT анализи.

Предизвикателство срещу ваксиния. На шест 9-седмични женски мишки BALB/c AnNcr-nu/nu бяха дадени интраперитонеални инокулации с 1 × 10 7 pfu пречистен щам vSC56, който беше предварително смесен с VIG или заешки IgG-пречистени антитела при стайна температура за 30 минути. Предишни експерименти показват, че тази процедура запазва количеството антитела, необходимо за защита, в сравнение с процедурите за дозиране на мишки с антитела преди инокулация. Мишките се претеглят ежедневно след предизвикателство и се евтаназират, когато загубят 25% от първоначалното си телесно тегло. С всички мишки се работи в съответствие със стандартите на CBER за институционални грижи и употреба на животните.

статистически анализи. В анализите за анулиране сравними проби със и без rA27 бяха анализирани с 2-опашен, сдвоен t тест на Student. В проучванията за защита се използва log-rank тест, за да се определи значимостта на разликите в оцеляването между групите. Статистически анализи, използвани JMP софтуер (версия 5.1; JMP).

РЕЗУЛТАТИ

Неутрализираща активност на антитела срещу А27. Функционалните отговори на антитела са изследвани в анализи на PRNT. Сред A27 имуногените, само rA27 демонстрира мощна неутрализираща активност (таблица 1, отгоре). Комбинацията от 5 антипептидни серума при разреждане 1:20 за всеки серум също няма неутрализираща активност (не е показана), което предполага, че неутрализиращите антитела не се предизвикват ефективно от пептидите. Въпреки че няколко анти-A27 неутрализиращи моноклонални антитела се свързват с линейни епитопи [31, 32], те бяха предизвикани чрез ваксинация с VACV [22]. Неспособността ни да повишим неутрализиращи антитела с пептида N26, който съдържа линейни епитопи за неутрализиране на моноклонални антитела, може да отразява необходимостта от естествена конформация A27 за индукция на неутрализиращи антитела. В сравнителни проучвания VIG и A27 IgG дават ∼20 и 1,8 µg/ml IC50s, съответно (таблица 1, отдолу). Видимата по-висока сила на rA27 IgG вероятно отразява, поне отчасти, факта, че PRNT анализите дават резултат само на MV, а не на извънклетъчните инфекциозни вируси (EV), които са склонни да бъдат крехки в културните запаси.

За фракциониране на VIG, 550 mg пречистен IgG, съдържащ 6.3 × 104 свързващи единици и 4.7 × 104 Nt50 единици, бяха приложени към колоната (таблица 2). Подобно на rA27 IgG, колоната премахва почти цялата A27 свързваща активност във VIG, която се възстановява във фракцията на елуата. За разлика от тях, по-голямата част от неутрализиращата активност (3.6 × 10 4 Nt50) остава във фракцията на потока и 2 Nt50). Този резултат не се дължи на претоварване на колоната, тъй като колоната е в състояние да премахне много по-голямо количество специфични за A27 антитела (таблица 2). По този начин специфичните за A27 антитела, предизвикани от ваксината Dryvax, се неутрализират, но представляват само малка част от неутрализиращите антитела, налични във VIG. По същия начин, когато измервахме специфична реактивност на MV във VIG, използвайки плочи, покрити с пречистен UV деактивиран MV, открихме, че 99% от реактивността, присъстваща в общия VIG, остава във фракцията на потока и само 0,4% се възстановява във фракцията на елуата (данните не показан). Тези резултати са в съответствие с резултатите от проучванията за неутрализация, които показват, че по-голямата част от индуцираните от Dryvax антитела, дори тези, насочени към MV, не са насочени срещу A27.

Допълнителни независими експерименти за оценка на A27 антитела във VIG (фигура 3) включват смесване на антитела с излишък rA27 преди употреба в PRNT анализи за адсорбиране и отмяна на специфична за A27 неутрализираща активност. Този метод имитира фракцията на потока в колоната, като директно измерва неутрализацията. Антителата бяха използвани в концентрации, близки до IC50, за да се увеличи максимално чувствителността при откриване на отмяна на неутрализираща активност (фигура 3, линии 3, 5 и 7). Съответно, когато A27 IgG беше предварително инкубирано с 2 ug rA27 (> 10-кратен моларен излишък), неутрализиращата активност беше отменена с 97% (фигура 3, път 4). Предварителното смесване на A27 IgG с отделни A27 пептиди или комбинации не намалява неутрализацията (данните не са показани). Значително е, че неутрализацията чрез VIG не е била значително намалена чрез инкубация с излишък rA27 (20 ug) преди инокулирането на клетки в PRNT анализи (фигура 3, път 6). Както се очаква, само rA27 не пречи на заразността (фигура 3, линии 1 и 2). Също така открихме, че rA27 намалява неутрализиращата активност във VIG елуата фракция от колоната A27 с 80% (фигура 3, път 8). Ние заключаваме, че VIG съдържа неутрализиращи антитела срещу A27, но тези антитела съставляват много малък компонент на неутрализиращите антитела във VIG.

Проучвания за защита с антитела срещу A27 и VIG. Тъй като анализите на PRNT измерват само неутрализираща активност срещу MV и се смята, че EVs са важни за разпространението в гостоприемника, предприехме експерименти in vivo, за да оценим по-нататък ефикасността на нашите поликлонални антитела A27 и дали те биха могли да увеличат VIG. Тези проучвания включват трансфер на антитела в голи имунодефицитни мишки и летално предизвикване с 1 × 10 7 pfu vSC56, VACV с дефицит на тимидин-киназа. Субоптималните дози имунни глобулини, определени в предварителни експерименти (данните не са показани), бяха използвани, за да се оцени дали може да се получи полза от комбинирането на A27 IgG и VIG. Ниските или високите дози на антитела срещу VIG или rA27 се сравняват, като се използва комбинация от антитела с ниски дози, които се равняват на общото количество на високи дози VIG (фигура 4). Антителата са нормализирани за общото количество IgG, а не за PRNT активност, тъй като неутрализиращата активност срещу MV и EV би била от значение in vivo.

Фигура 4 показва частична защита и при двете дози в групите, лекувани с A27 IgG (8 и 24 mg) и VIG (4 и 12 mg), в сравнение с контролните групи, получаващи само VACV или VACV, третирани с 24 mg нормален заешки имуноглобулин (NR IgG) (P 23], но доколкото ни е известно, нашите резултати са първата демонстрация, че поликлоналните антитела към рекомбинантен протеин A27 могат пасивно да предпазват имунодефицитните животни от летално предизвикателство.

Както се очаква, VIG също така защити мишки чрез значително удължаване на преживяемостта в сравнение с контролните групи (P 5). Тези проучвания за защита показват, че антителата срещу A27 могат да увеличат защитата от VIG и предполагат, че настоящите ваксини могат да бъдат подобрени чрез подобряване на отговора на антителата към A27.

ДИСКУСИЯ

Отговорите на антитела A27 често се откриват след имунизация с ваксини на базата на VACV [29, 33], но тяхното значение за защита е неизвестно. За да информираме за проектирането и оценката на новите ваксини срещу едра шарка и терапевтичните имунни глобулини, ние изследвахме приноса на специфични за A27 антитела, предизвикани от Dryvax, за неутрализирането и защитата на вируса и допълнително изследвахме потенциала на антителата A27 за увеличаване на защитата.

Индуцирани с висока дължина на rA27 антитела с висок титър с мощна неутрализираща активност (таблица 1), които подобряват пасивната защита чрез VIG при имунодефицитни мишки (фигура 4). Тези резултати са в съответствие с нашите открития, че Dryvax не индуцира големи количества A27 антитела (фигури 2 и 3). Неотдавнашен доклад, изследващ отговорите на антитела при лица, имунизирани с щама Lister на VACV, също предполага, че неутрализацията на MV не се доминира от отговорите на A27, за разлика от неутрализацията на EV, която изглежда е доминирана от единичен протеин (B5) [34]. Необходими са допълнителни изследвания, за да се определи дали антителата срещу други протеини, потенциално участващи в мултипротеинов фузионен комплекс, са важни компоненти на индуцирания от ваксината имунитет [35, 36].

Признание

Благодарим на Американската администрация по храните и лекарствата, Центъра за оценка на биологичните изследвания и колегите от изследванията д-р Майк Кенеди, Нанси Елър и Джери Уиър за полезни дискусии и доктори. Дот Скот и Маргарет Баш за критично четене на ръкописа.