Методология на ролите, валидиране, писане - оригинален проект

прогностична

Партньорски център за върхови постижения по хепатит и рак на черния дроб, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Роли Формален анализ, методология, визуализация

Партньорски център за върхови постижения по хепатит и рак на черния дроб, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Методология на ролите, валидиране

Катедра по биохимия, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Роли Формален анализ, методология, ресурси, надзор

Катедра по биохимия, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Ресурси за роли, валидиране

Катедра по радиология, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Роли Ресурси, надзор, валидиране

Отделение по хирургия, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

Роли Концептуализация, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Партньорски център за върхови постижения по хепатит и рак на черния дроб, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн, Банкок, Тайланд

  • Порнпитра Пратерат,
  • Наттая Чуайпен,
  • Pattaraporn Nimsamer,
  • Sunchai Payungporn,
  • Nutcha Pinjaroen,
  • Boonchoo Sirichindakul,
  • Писит Тангкийванич
  • Член
  • Автори
  • Метрика
  • Коментари
  • Медийно покритие
  • Партньорска проверка

Фигури

Резюме

Заден план

Доказано е, че циркулиращите микроРНК (miRNAs) нарушават регулацията при много видове рак, включително хепатоцелуларен карцином (HCC). Целта на това проучване беше да се изследват потенциалните диагностични или прогностични роли на циркулиращите miRNAs при пациенти с HCC, свързани с вируса на хепатит В (HBV).

Методи

Сдвоени ракови и съседни неракови чернодробни тъканни проби от пациенти с HBV-свързана HCC са използвани като набор за откриване за скрининг на 800 miRNAs чрез количествен анализ на Nanostring. След това диференциално експресираните miRNAs бяха изследвани чрез SYBR зелена количествена RT-PCR в валидационна кохорта от серумни проби, получени от 70 пациенти с HCV, свързани с HCC, 70 пациенти с HBV без HCC и 50 здрави контроли.

Резултати

Комплектът за откриване идентифицира miR-223-3p, miR-199a-5p и miR-451a значително по-ниски, изразени в ракови тъкани в сравнение с неракови тъкани. Във валидираната кохорта нивата на циркулиращ miR-223-3p са значително по-ниски в групата на HCC в сравнение с другите групи. Комбинираното използване на серумен алфа-фетопротеин и miR-223-3p показва висока чувствителност за откриване на ранен HCC (85%) и HCC на междинен/напреднал стадий (100%). Освен това, серумният miR-223-3p имаше отрицателна корелация с размера на тумора и BCLC стадия. При многовариантния анализ серумният miR-223-3p е идентифициран като независим прогностичен фактор за общата преживяемост при пациенти с HCC. За разлика от това, циркулиращите miRNA-199a-5p и miR-451a не показват никаква клинична полза за диагнозата и прогностичната прогноза на HCC.

Заключения

Нашите резултати демонстрираха, че miR-223-3p е диференцирано експресиран в ракови в сравнение със сдвоени съседни неракови тъкани. В допълнение, циркулиращият miRNA-223-3p може да представлява нов диагностичен и прогностичен маркер за пациенти с HCV, свързан с HBV.

Цитат: Pratedrat P, Chuaypen N, Nimsamer P, Payungporn S, Pinjaroen N, Sirichindakul B, et al. (2020) Диагностични и прогностични роли на циркулиращата miRNA-223-3p в хепатоцелуларен карцином, свързан с вируса на хепатит В. PLoS ONE 15 (4): e0232211. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0232211

Редактор: Изабел Чемин, Център за проучване и канцерология на Лион, ФРАНЦИЯ

Получено: 9 октомври 2019 г .; Прието: 9 април 2020 г .; Публикувано: 24 април 2020 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни се намират в ръкописа и в неговите поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Изследванията, отчетени в тази публикация, са подкрепени от Тайландския изследователски фонд (RTA6280004), стипендията за Chula Research Scholar (CU-GRS-60-06-30-03), доктора на Кралския златен юбилей. Програма (грант № PHD/0061/2559) и Център за върхови постижения по хепатит и рак на черния дроб, Медицински факултет, Университет Чулалонгкорн. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите заявяват, че няма конфликт на интереси.

Въведение

Хепатоцелуларният карцином (HCC) представлява шестият най-често срещан рак и втората водеща причина за смъртност, свързана с рака в световен мащаб [1]. Разпространението на HCC се различава сред географското разпространение с високия му процент в Източна и Югоизточна Азия [2]. В Тайланд основните етиологични фактори за развитието на HCC са вирусът на хепатит В (HBV), последван от инфекция с вируса на хепатит С (HCV), алкохолно чернодробно заболяване (ALD) и безалкохолно мастно чернодробно заболяване (NAFLD). Нашият предишен доклад демонстрира, че поне 60% от случаите на HCC се дължат на хронична HBV инфекция [3]. Въпреки напредналите подобрения в лечебното лечение, включително хирургични и аблативни терапии, общата преживяемост на пациентите с HCC остава незадоволителна поради туморната агресивност при представяне и високата честота на рецидиви [2]. Понастоящем прогностичните маркери за HCC в рутинната клинична практика все още не са налични. По този начин надеждният серумен биомаркер за ранна диагностика, мониторинг на прогресията на тумора и прогностично прогнозиране е изключително необходим и би имал голяма клинична полза.

В това проучване изследвахме глобално профилиране на експресия на miRNA в проби от чернодробна тъкан, получени от пациенти с HCV, свързани с HCC чрез количествена платформа NanoString. Освен това потвърдихме клиничната значимост на кандидат-miRNAs чрез PCR в реално време в друг набор от серумни проби, получени от пациенти с HCV, свързани с HBV.

Материали и методи

Пациенти и събиране на проби

За да се изследват профилите на експресия на miRNA в чернодробната тъкан, двойки ракови и съседни неракови тъканни образци са получени от пациенти с HCV, свързани с HCC, подложени на хирургична резекция в катедрата по хирургия, Университет Chulalongkorn от 2013 до 2017 г. Диагнозата на HCC е потвърдена по хистопатология. Чернодробните тъканни проби веднага се съхраняват в по-късен разтвор на РНК (Cat No. 76106, QIAGEN и Германия) и след това се замразяват в течен азот до екстракция на РНК.

За кохортата за валидиране се събираха съхранявани серумни проби от пациенти със свързан с HBV HCC, които бяха диагностицирани за първи път в мемориалната болница King Chulalongkorn, Банкок, Тайланд между 2013 и 2017 г. Диагнозата на HCC в тази кохорта се базира на типични образни изследвания и/или хистопатология в съответствие с насоките на Американската асоциация за изследване на чернодробните заболявания (AASLD) [10]. Накратко, критериите за HCC диагностика бяха включени фокални чернодробни лезии с хиператунуация в артериалната фаза и хипоатенуация в порталната фаза при динамична компютърна томография (CT) или ядрено-магнитен резонанс (MRI). Извършена е чернодробна биопсия или аспирация с фина игла, за да се потвърди диагнозата HCC в случаи без типични образни характеристики. Избрани са изходни клинични параметри на тези пациенти, които включват пол, възраст, биохимични чернодробни функционални тестове, класификация по Child-Pugh, серумен алфа-фетопротеин (AFP) и стадий на HCC, класифициран от рак на черния дроб на клиниката в Барселона (BCLC) [11]. Освен това се записва обща преживяемост (OS) на пациентите, характеризираща се с интервала между първоначалното набиране и смърт или последното последващо посещение.

Съхранени серумни проби също са получени от две допълнителни групи, включително здрави кръводарители без видимо чернодробно заболяване (здрави контроли) и пациенти с хронична HBV инфекция, които нямат доказателства за HCC (групата, която не е HCC). Здравите контроли и групата, която не е от HCC, бяха съпоставени по пол и възраст с пациентите с HCC, за да се намалят объркващите ефекти. Диагнозата на хроничната HBV инфекция се потвърждава от наличието на серумен антиген на хепатит В (HBsAg) в продължение на поне 6 месеца. Пациентите с HCV и/или ко-инфекция с вируса на човешка имунна недостатъчност (HIV) бяха изключени. Събраните проби от серумни проби се разделят чрез центрофугиране и се съхраняват при -70 ° C до допълнително тестване.

Това проучване е проведено съгласно Декларацията от Хелзинки за участие на човешки индивиди. Протоколът от това проучване е одобрен от Институтската комисия по етика на Медицински факултет на Университета Чулалонгкорн (IRB № 726/60) и е получено писмено информирано съгласие от всеки участник.

Анализ на Nanostring nCounter

Общо РНК, извлечени от 25 mg HCC замразени тъкани и съвпадащи съседни неракови тъкани, се екстрахират поотделно за miRNAs, като се използва GenUP ™ Total RNA Kit (Biotechrabbit GmbH, Hennigsdorf, Германия). Тези РНК бяха определени за обща експресия на 800 miRNA, използвайки Human nCounter miRNA Assay v 3.0 комплект, следвайки инструкциите на производителя (NanoString Technologies, Сиатъл, Вашингтон, САЩ). Кандидатните miRNAs бяха избрани, ако тяхната диференциална експресия в ракови и неракови тъкани беше повече от 5 пъти.

Валидиране на резултатите от NanoString чрез qRT-PCR анализ

Статистически анализ

Анализът на NanoString беше извършен с помощта на софтуер за анализ nSolver (Версия 4.0). Данните според нивата на диференциални изрази на miRNAs бяха анализирани със SPSS статистика версия 22 (SPSS Inc., Чикаго, IL) и GraphPad Prism 5.0 (софтуер GraphPad, CA, USA). Количествените данни са изчислени като средно ± стандарт и проценти. Сравненията между групите бяха анализирани чрез χ 2 или точния тест на Fisher за категорични променливи и чрез t-критерия на Student за количествени променливи. Корелациите между базовите параметри бяха анализирани чрез ранг теста на Спиърман. Кривите на оцеляване са изчислени на базата на анализ на Каплан-Майер и тест за лог-ранг. Регресионният анализ на Cox е проведен за идентифициране на независими изходни фактори, свързани с общата преживяемост (OS) на пациенти с HCC. Стойности на P Фигура 1. Графиката на вулкана показва профила на диференциалната експресия на miRNAs в 4 тъканни проби на пациенти с HCC.

Оста x представлява промяната на Log2 пъти, а оста y представлява нивото на значимост, изразено като P-стойност-log10. Червените 3 точки, показани на вулкановия парцел, са регулираните надолу miRNAs в HCC тъкан. Сините точки представляват miRNAs, които не демонстрират значителна промяна в експресията. Стойността на значимостта е посочена с гранична стойност на Р-стойност 0,05.

Проверка на съотношенията на miRNA чрез RT-qPCR

За по-нататъшно изследване дали циркулиращата експресия на miRNA може да се приложи за диагностика на HCC; RT-qPCR беше извършен в серумни проби от кохорта за валидиране, състояща се от 70 пациенти с HCV, свързани с HBV, 70 пациенти без HCC и 50 здрави контроли. Сред тези индивиди здравите контроли и групата, която не е от HCC, бяха съпоставени по пол и възраст с пациенти с HCC (Таблица 1). В сравнение с пациенти без HCC, групата на HCC има значително по-нисък серумен албумин и брой тромбоцити, но по-висок серумен общ билирубин, аспартат аминотрансфераза (AST), аланин аминотрансфераза (ALT), ниво на AFP, наличие на генотип С на HBV и цироза. Няма значителна разлика по отношение на HBeAg позитивност и ниво на HBV ДНК. Сред HCC групата първоначалните стадии на рак, базирани на критериите за BCLC, са както следва: 21 (30,0%), 24 (34,3%) и 25 (35,7%) пациенти съответно в стадии 0-A, B и C-D.

За по-нататъшен анализ бяха избрани три miRNAs, включително miR-223-3p, miR-199a-5p и miR-451a, идентифицирани в настройката за откриване и за които е известно, че не са регулирани в HCC. Относителните нива на miRNAs на експресията на субектите във всяка група са нанесени на фигури 2А, 2В и 2С. Резултатите показаха, че нивата на циркулиращ miR-223-3p в HCC групата (0.31 ± 0.46) са значително по-ниски от групата, която не е HCC (0.94 ± 1.05, P Фиг. 2.

Относителна експресия на серум (A) miR-223-3p, (B) miR-199a-5p и (C) miR-451a в изследвани групи.

Връзка между нивата на серумните miRNAs и клиничните параметри

Сред пациентите с HCC беше изследвана корелацията между серумните нива на miRNAs и клиничните параметри на изходно ниво. Няма връзка между miR-223-3p и miR-199a-5p (r = 0,118, P = 0,329), miR-223-3p и miR-451a (r = -0,059, P = 0,28), както и miR -199a-5p и miR-451a (r = 0,149, P = 0,218). Серумен miR-223-3p имаше отрицателна корелация с размера на тумора (r = -0.312, P = 0.008) и BCLC стадия (r = -0.410, P Фигура 3. Площта под кривата (AUROC) на HCC и другите групи.

По отношение на всички HCC, 56 от 70 (80,0%) пациенти са имали намалени нива на серумен miR-223-3p Таблица 2. Чувствителността на серумния miR-223-3p, AFP и комбинация при диагностициране на HCC според туморната постановка.

MiRNAs в серума при прогнозиране на общата преживяемост на пациенти с HCC

Освен клиничните корелации, ние допълнително изследвахме потенциалната прогностична роля на серумните miR-223-3p, miR-199a-5p и miR-451a. Използвайки средната стойност (0,13) като гранично ниво, медианата на OS при пациенти със серумни нива на miR-223-3p ≥0,13 е 44,4 месеца, което е значително по-добро от това на пациенти, чиито серумни нива са Фиг. 4. Асоциация от изследваните miRNAs с обща преживяемост при пациенти с HCC.

(A) miR-223-3p (B) miR-199a-5p (C) miR-451a.

Нивата на серумни miR-223-3p, miR-199a-5p и miR-451a бяха въведени в едномерния анализ заедно с други променливи, които могат да повлияят на прогнозата на HCC. Тези изходни фактори включват възраст, пол, нива на AST и ALT, брой на тромбоцитите, HBeAg статус, ниво на HBV ДНК, ниво на AFP, класификация на деца, размер на тумора и BCLC етап. Сред тези параметри, AFP, размерът на тумора, BCLC стадийът и серумният miR-223-3p бяха избрани за многовариатен анализ. Въз основа на многовариантния анализ, данните разкриват, че независими прогностични фактори на OS са BCLC стадий и серумен miR-223-3p (Таблица 3).

Дискусия

Нарастващите доказателства сочат критична роля на miRNAs в хепатокарциногенезата [4]. Добре известно е, че тези малки некодиращи РНК участват в пост-транскрипционната регулация на генната експресия и много клетъчни процеси като растеж, ангиогенеза, диференциация и метастази [6]. Последните данни показват, че дерегулацията на miRNA вече се открива при прекалено злокачествени лезии, включително нискостепенни или високостепенни диспластични възли, което показва техния принос в ранните етапи от развитието на HCC [14]. Нещо повече, дерегулираните miRNAs са показани като основни модулатори в туморната прогресия и агресивност, при които те действат като онкогени или туморни супресори [7]. Като се има предвид техният принос в различни етапи на хепатокарциногенезата и тяхната стабилност в телесните течности, изглежда, че циркулиращите miRNAs могат да служат като потенциални диагностични и прогностични биомаркери за HCC.

Настоящото проучване е предназначено основно за сравняване на експресията на miRNAs в тъканни проби на пациенти с HCV, свързана с HBV, и след това валидира клиничното значение на избраните кандидат-miRNAs в серумни проби. В кохортата на откритията приложихме платформата NanoString, която позволи откриването на тъканни miRNAs с висока чувствителност и специфичност. Въз основа на тази техника, ние идентифицирахме 29 miRNAs, които бяха значително диференцирано експресирани в ракови и неракови тъкани. Сред тях, miR-223-3p беше значително регулиран надолу, изразен в ракова тъкан в сравнение със съответните им контроли. Подобна констатация е в съгласие с предишни данни, които показват, че силно дерегулираната експресия на miR-223 може значително да различи HCC от съседния нераков черен дроб, независимо от състоянието на вирусен хепатит [15, 16]. Например, репресираната експресия на miR-223 в ракови тъкани, получена от пациенти с хроничен вирусен хепатит, показва средно 5-кратно намаление в сравнение с нераковия аналог, докато съответната цифра, наблюдавана при тумори, получени от не-В не-С HCC, е приблизително 3,5-кратно намаление [15]. По този начин променената експресия на miR-223-3p в чернодробната тъкан предполага, че тази miRNA може да притежава стойност като нов биомаркер за HCC.

Освен това, нашите резултати показаха, че има отрицателна корелация между понижаване на регулацията на серумен miR-223-3p и по-агресивно туморно поведение при пациенти с HCC. По-конкретно, намалено ниво на miR-223-3p се наблюдава по-често при пациенти с голям размер на тумора и напреднали BCLC стадии. В допълнение, анализът на преживяемост на Kaplan-Meier показа, че общата преживяемост на ниско серумната miR-223-3p група значително отстъпва на тази на високо експресиращата група miR-223-3p. И накрая, многовариантният анализ потвърди, че намаленото серумно ниво на miR-223-3p е независим, неблагоприятен предиктор за цялостната преживяемост. Доколкото ни е известно, този доклад е първият, който демонстрира прогностичното значение на циркулиращия miR-223-3p при пациенти с HCC.

Този доклад има някои ограничения като ретроспективна кохорта, която набира сравнително малък брой пациенти. Освен това, нашето проучване включва само пациенти с хронична HBV инфекция, което може да не е приложимо за други етиологични причини за хронично чернодробно заболяване, като хронична HCV инфекция, ALD и NAFLD. Въпреки тези ограничения, нашите данни ясно показват, че miR-223-3p е диференцирано експресиран в ракови тъкани в сравнение със сдвоени съседни тъкани. В допълнение, циркулиращите нива на miRNA-223-3p могат да разграничат HCC от групите, които не са HCC. Освен своята диагностична роля, тази циркулираща miRNA може да служи и като обещаващ прогностичен биомаркер на HCV, свързан с HBV. По-нататъшни изследвания си струват, за да се потвърдят тези наблюдения и да се изясни клиничното значение на серумната miRNA-223-3p при пациенти с HCC.