Училище за биологични науки, Университет на Куинсланд, Бризбейн, Куинсланд, Австралия; и

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: H. Winwood-Smith, Училище за биологични науки, Университет на Куинсланд, Бризбейн 4072, Австралия (имейл: [имейл защитен]).

Училище за биологични науки, Университет на Куинсланд, Бризбейн, Куинсланд, Австралия; и

Център за геометрична биология, Училище за биологични науки, Университет Монаш, Мелбърн, Виктория, Австралия

Резюме

Някои от механизмите, чрез които диетите с ниско съдържание на въглехидрати и високо съдържание на протеини водят до успех при отслабване, са добре разбрани. Обикновено се съобщава, че съществува йерархия на засищане с макронутриенти, при която апетитът се задоволява най-лесно в низходящ ред на протеини, въглехидрати и мазнини (15, 72), а многобройни проучвания върху хора демонстрират засилените ефекти на ситост и засищане на протеините ( 6, 21, 26, 35, 63, 66, 71, 77, 81). Освен това, поради различните пътища, по които макроелементите се окисляват, нетният добив на АТФ ще варира в зависимост от калорията на даден субстрат, като протеинът дава сравнително по-малко АТФ (12, 13). Това отчасти обяснява увеличаването на енергийните разходи в покой при хора на диета с ниско съдържание на въглехидрати и високо протеини (35, 43, 80). Въпреки това, почти половината от това увеличение на енергийните разходи в покой се дължи на повишеното регулиране на глюконеогенезата в отговор на намалените запаси на гликоген, резултат от намаления прием на въглехидрати (3, 27, 74). Засиленото насищане, по-ниският енергиен добив и увеличените енергийни разходи, съчетани с липсата на доказателства, които да предполагат, че диетите с ниско съдържание на въглехидрати и високо протеини имат неблагоприятни ефекти върху здравето, доведоха до препоръката, че такива диети са ефективно средство за отслабване и поддържане на теглото (40).

Тестването на такава хипотеза при хора е по същество проблематично, предвид трудностите при проектирането на наистина слепи опити, при които експерименталната ситуация не влияе подсъзнателно на субекта (28). Поради тази причина животинските модели могат да бъдат по-подходящи за оценка на неволеви поведенчески реакции. Плодовата муха D. melanogaster все по-често се използва за изследване на механистичните основи на човешкото хранене и затлъстяване (70). С нарастването на нашата зависимост от този модел е изключително важно да разберем къде са физиологичните механизми между хората и Дрозофила са консервирани и където се различават. Диети с високо съдържание на въглехидрати (

1: 6.5 съотношение протеин към въглехидрати) са били използвани за производство на затлъстели, диабетични мухи (45), а физиологията на въглехидратния и липидния метаболизъм е запазена до голяма степен между мухите и хората (18, 49, 67, 70). Дрозофила и е доказано, че хората проявяват подобни реакции на промени в приема на въглехидрати и протеини в храната. Има някои доказателства, които предполагат, че диетите с по-високо съдържание на протеин предизвикват повишаване на скоростта на метаболизма (MR) и намаляват съдържанието на въглехидрати в цялото тяло при възрастни Дрозофила (6а) и диетите с ларви с ниско съдържание на въглехидрати намаляват запасите от гликоген при възрастни (41). Освен това, Дрозофила разчитайте и бързо консумирайте гликоген по време на полет и непрекъснато консумирайте гликоген, макар и с много по-ниска скорост, за да подхранва метаболизма в покой (85).

В настоящото изследване изследвахме възможната връзка между нивата на гликоген и спонтанната активност и ефектите от намаления прием на въглехидрати с храната върху енергийния метаболизъм. MR, доброволната активност и нивата на гликоген се измерват ежедневно и консумацията на храна се измерва на всеки 3 дни, за да се проверят следните хипотези: 1) запасите от гликоген са свързани с намаляване на физическата активност; 2) запасите от гликоген ще намаляват при започване на диета с ниско съдържание на въглехидрати, но се възстановяват с течение на времето поради промени в енергийните разходи; и 3) диетата с ниско съдържание на въглехидрати ще бъде свързана с увеличаване на MR в покой.

Проучване на животни

Всички експерименти бяха проведени върху масово отглеждана популация от D. melanogaster. Мухите бяха диво уловени в Coldstream, Виктория, Австралия и бяха създадени 30 женски линии чрез развъждане на потомството (F1) от отделни жени, за да се създаде поколение F2. Десет девствени мъжки и 10 девствени женски F2 мухи от всяка линия (общо 600) бяха поставени в бутилка, за да създадат масово отглежданата популация. Тази популация се поддържа при 25 ° C под 12: 12-часов светло-тъмен фотопериод върху среда от полента-захар-дрожди (105,5 g полента, 18 g дрожди, 91,5 g захароза, 11,5 g агар, 5 ml нипагин и 5 ml пропионова киселина в 1,1 литра вода).

Експериментален протокол

Експериментални животни.

Жилищен апарат.

Експерименталните мухи бяха настанени индивидуално, като се използва модифицирана версия на анализа на капилярния фидер (CAFE) (23) при 25 ° C при 12: 12-часов светло-тъмен фотопериод. Мухите се съдържат в епруветки от 5 ml (Falcon, BD Biosciences, Сан Хосе, Калифорния) и се хранят с течна диета от дестилирана вода, автолизирана мая (MP Biomedicals, Санта Ана, Калифорния) и захароза, съдържаща се в 5-μl капилярна тръба (Drummond Microcaps, Drummond Scientific, Broomall, PA или Hirschmann Minicaps, Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt, Германия), който беше вкаран през отвор в капака на тръбата. За да се избегне изсушаване на животните и да се предотврати разчитането на течната диета за хидратация, всяка туба съдържа 1 ml 0,5% разтвор на агар (5 g агар, 5 ml нипагин и 5 ml пропионова киселина в 1 литър вода) . Тръбите бяха държани в общо осем стелажа, две стелажи на един от четирите 48-литрови пластмасови контейнера за съхранение (Really Useful Products, Normanton, West Yorkshire, UK). Стойки бяха монтирани една над друга в ориентация, която държеше тръбите вертикално. За да се сведе до минимум изпарението на течните диети, овлажнен въздух се изпомпва в контейнера чрез 20-l/min аквариумна помпа (Resun AC-9908, Shenzhen Xing Risheng Industrial, Shenzen, China), която подава въздух през четири бутилки за миене на газ ( Schott, French's Forest, NSW, Австралия).

Диетични лечения.

Мухите са хранени с една от двете диети по време на експерименталния протокол: стандартна (ST) диета със съотношение протеин към въглехидрати 1: 4 и диета с ниско съдържание на въглехидрати (LC) със съотношение протеин към въглехидрати от 1: 1. Съотношението за ST диетата е избрано въз основа на доклада на Lee et al. (34) че, когато има избор, D. melanogaster ще избере съотношение 1: 4. Тези съотношения на макроелементи бяха постигнати чрез промяна на съотношението на автолизирани дрожди и захароза, които бяха разтворени в дестилирана вода и направени до обща концентрация от 400 g/l с 0,1% нипагин и 0,1% пропионова киселина, за да се предотврати микробния растеж. Диетата ST съдържа 5 g захароза и 10,5 g мая, а LC диетата съдържа 3,58 g захароза и 11,92 g мая; и двете диети съдържат 38,75 μl нипагин и 38,75 μl пропионова киселина и са допълнени до обем от 38,75 ml с дестилирана вода. Избрана е концентрация от 400 g/l, за да се избегнат ограниченията върху усвояването на хранителни вещества поради обема на погълнатата вода, което може да бъде ограничение при разредени диети, и тъй като при диетични концентрации от 45–360 g/l е установено, че дълголетие се увеличава с концентрация (34).

Експериментален дизайн и график

MR и активност.

Консумация.

На дни 3, 6, и 9, всички захранващи капиляри бяха отстранени и заменени с епруветки, съдържащи свежи диети. За измерване на храната, консумирана през предходните 3 дни, тръбите се подреждат и снимат върху парче ламинирана хартия с решетка 1 mm. За корекция на снимките в перспектива е използван софтуер за обработка на изображения на Фиджи (www.fiji.sc) и е измерено намаляването на размера на хранителната колона във всяка микрокапиляра. За да се отчете ефектът от изпарението, за всяко третиране във всяка решетка средното намаляване на размера на колоната от двата контрола за изпаряване се изважда от измереното намаление за всяка капиляра, от която се е хранило животно. Тъй като автолизираните дрожди и захароза имат приблизително еднакво енергийно съдържание на единица маса (38), диетите се считат за еднакво калорични и следователно се изразяват и обсъждат като консумирани единици за обем.

Нива на гликоген.

Статистически анализи

Данните за всяка черта бяха анализирани с линеен модел със смесени ефекти, като се използва максимална вероятност с пакета lme4 v1.1-12 (4) на R v3.3.0 (53) в RStudio v0.99.902 (55). Включени са двупосочни взаимодействия между диетата и всички други фиксирани фактори. Значението на случайните ефекти беше изследвано първо с помощта на тестове за съотношение на вероятността и незначителните ефекти бяха отстранени от следващите модели. След това значимостта на останалите фиксирани ефекти в рамките на този минимално адекватен модел беше тествана с помощта на тестове за вероятност. Случайните ефекти бяха запазени в рамките на минималния адекватен модел, ако са значими при α = 0,25, както се препоръчва от Quinn and Keough (52), и α беше определен на 0,05 за тестове за значимост за фиксираните ефекти. Денът е общ фиксиран фактор за всички анализирани черти и се третира като категоричен, а не като непрекъснат фактор, тъй като промените в променливите на отговора с течение на времето не изглеждат линейни. За всяка черта бяха направени сравнения по двойки за всеки ден чрез премахване на фиксирания ефект на деня и всякакви взаимодействия от минимално подходящите модели.

Скорост на метаболизма.

Първоначалният модел за MR включваше фиксираните ефекти от диетата, деня, активността, масата и времето (на деня) и случайните ефекти на анализатор, канал, контейнер, отгоре/отдолу (багажник), ляво/дясно (позиция в багажник), и тичай. Двупосочните взаимодействия на диета × време и диета × активност, заедно с всички случайни ефекти с изключение на бягане (χ 2 1 = 44,2, P 2 1 = 1,93, P = 0,165), са незначителни. Крайният модел, използван за обяснение на MR, е MR

диета + ден + маса + време + диета × ден + диета × маса + анализатор + бягане. Моделът, използван за post hoc двойни сравнения за всеки ден, беше MR

диета + активност + маса + време + анализатор + бягане.

Първоначалният модел за маса включваше фиксираните ефекти от диетата, деня и времето и случайните ефекти на анализатор, канал, контейнер, отгоре/отдолу (багажник), ляво/дясно (позиция в багажник) и бягане. Двупосочното взаимодействие на диета × време, заедно с всички случайни ефекти с изключение на контейнера (χ 2 1 = 6.35, P 2 1 = 102,42, P 2 1 = 3.8, P = 0,051), отгоре/отдолу (χ 2 1 = 1,34, P = 0,247) и канал (χ 2 1 = 1,64, P = 0.201), са незначителни. Крайният модел, използван за обяснение на MR, е активността

диета + ден + маса + време + канал + отгоре/отдолу + бягане. Моделът, използван за post hoc двойни сравнения за всеки ден, е активност

диета + маса + време + канал, отгоре/отдолу + бягане.

Консумация.

Първоначалният модел за консумация включваше фиксираните ефекти от диетата и деня и случайните ефекти от контейнера, отгоре/отдолу, отляво/отдясно и бягането. Въпреки че консумацията на много индивиди се измерва многократно, това не се проследява, тъй като процесът отнема много време и е логично сложен. Всички фиксирани фактори и взаимодействия бяха значими, както и всички случайни ефекти на контейнера (χ 2 1 = 9,57, P = 0,002), отгоре/отдолу (χ 2 1 = 76,03, P 2 1 = 4.88, P = 0,027) и изпълнете (χ 2 1 = 242,17, P = 0,001). Крайният модел, използван за обяснение на нивото на потребление, е потреблението

диета + ден + диета × ден + контейнер + отгоре/отдолу + ляво/дясно + бягане. Моделът, използван за post hoc двойни сравнения за всеки ден, е консумацията

диета + диета × ден + контейнер + отгоре/отдолу + ляво/дясно + бягане.

Запаси от гликоген.

Първоначалният модел за консумация включваше фиксираните ефекти от диетата и деня и случайните ефекти на G-плоча (96-ямковото плато за измерване на глюкозата) и P-плочата (96-ямковото плато, използвано за измерване на протеина), реагент партида и стартирайте. Тъй като всяка отделна точка от данни се получава от анализ на пет мухи, произволно взети проби от всички стелажи и контейнери, факторите на багажник, отгоре/отдолу и отляво/отдясно не са били от значение за анализа. Всички фиксирани фактори и взаимодействия, както и случаен ефект от пробега (χ 2 1 = 22.762, P резултати за обосновка). Тези корекции се постигат чрез изваждане от всяка стойност на средната разлика между тази стойност и прогнозната стойност за средно животно. Например, за животно с тегло 0,57 mg с MR 1, което трябва да се коригира до средната маса 1,07, като се използва оценка на параметъра за ефекта на маса 0,2, разликата между 0,57 и 1,07 (-0,5) се умножава по оценка на параметри от 0,2 и се изважда от MR на животното от 1 [1 - (0,57 - 1,07) × 0,2], като се получава коригиран MR от 1,1.

предизвиква

Фиг. 1.Промени в телесната маса и скоростта на метаболизма (MR) при мухи, хранени с нисковъглехидратна (LC) и стандартна (ST) диета с течение на времето. Горе вляво: промени в телесната маса с течение на времето. Горе в дясно: MR, коригиран до ниво на активност 0. Отдолу вляво: MR, коригиран до ниво на активност 0 и ниска телесна маса (10-ти процентил от наблюдаваните маси, 1,07 mg). Долу вдясно: MR, коригиран до ниво на активност 0 и висока телесна маса (90-ия процентил от наблюдаваните маси, 1,52 mg). Анализът на MR показва значителен ефект от активността и 2 значими двупосочни взаимодействия: диета × ден и диета × маса. Анализът на масата показва значителен ефект от двупосочната диета × дневно взаимодействие (н = 38–40 точки за всяка диета-дневна комбинация). * Статистически значими двойни разлики за всеки ден: P

Скорост на метаболизма

Налице е значителен ефект от диетата × дневно взаимодействие (χ 2 8 = 36.967, P 2 8 = 27,51, P 2 1 = 9,41, P = 0,002), а оценките на параметрите показват, че наклонът за активност е отрицателен и значително се различава от 0, което показва спад в активността и при двете диетични лечения с течение на времето.

Фиг. 2.Промени в активността при мухи, хранени с LC и ST диети с течение на времето. Анализът показва значителен ефект на деня върху активността (н = 38–40 точки от данни за всяка комбинация ден-активност). Анализите по двойки не показват значителни разлики между диетите на всеки ден.

Консумация

Налице е значителен ефект от диетата × дневно взаимодействие (χ2 2 = 12.736, P

Фиг. 3.Ниво на консумация (µl за 3 дни) при мухи, хранени с LC и ST диети с течение на времето. Анализът показва значително двустранно взаимодействие с диета × ден (н = 339–1 810 точки от данни за всяка комбинация ден-активност). Броят на точките с данни намалява по-късно в експеримента, тъй като мухите се изхвърлят след измерване на признаците. * Статистически значими двойни разлики за всеки ден: P

Магазини за гликоген

Налице е значителен ефект от диетата × дневно взаимодействие (χ 2 8 = 25,56, P = 0,001) върху нивата на гликоген (фиг. 4). Въпреки че имаше значителен ефект от диетата × дневно взаимодействие и post hoc тестовете разкриха, че нивата на гликоген са значително различни между LC и ST диетите през всички дни, с изключение на ден 3, визуално изследване на данните предполага, че нивата на гликоген са стабилни в LC групата, но намаляват в ST групата (Фиг. 4). За по-нататъшно изследване на хода на нивата на гликоген, минималният адекватен модел беше монтиран на ден като непрекъснат предиктор; в този модел диетата × дневно взаимодействие остава значителна (χ 2 1 = 13.4, P 0, но наклонът за ST диетата е значително по-отрицателен от този за LC диетата и има значително по-висок интервал. Това показва, че нивата на гликоген в групата LC са положителни и стабилни във времето, докато в групата ST първоначално са по-високи, но намаляват с времето. Следователно тези оценки на параметрите предполагат, че нивата на гликоген биха се сближили, ако експериментът продължи за по-дълго време, въпреки че времето, в което те биха могли да се сближат, не е изчислено, тъй като това ще изисква екстраполация извън обхвата на измерените данни.

Фиг. 4.Промени в нивата на гликоген при мухи, хранени с LC и ST диети с течение на времето. Анализът показва значително взаимодействие с диета × ден (н = 9–12 точки от данни за всяка комбинация гликоген-ден). * Статистически значими двойни разлики за всеки ден: P

Трябва да се признае, че не можем да разграничим ефектите от намаления прием на въглехидрати от увеличения прием на протеини, както и на липиди, витамини и други елементи в автолизираната мая. Възможно е отговорите да се ръководят от тези увеличения на други макро- или микроелементи. Що се отнася до протеина, изглежда малко вероятно механизмите, чрез които повишеният му прием повишава MR, които са свързани с биохимичните пътища, участващи в неговото окисление (12), да престанат да се прилагат с течение на времето. Намаляването на регулацията на глюконеогенезата и някои други метаболитни пътища изглежда по-правдоподобното обяснение, особено като се има предвид очевидната последователност между тази интерпретация и цитираните проучвания върху хора. Независимо от това, това предупреждение е необходимо.

Данните за нивото на потребление предоставят най-големия пъзел, когато всички измервания се разглеждат заедно. Въпреки че има значително двупосочно взаимодействие с диета × ден, всички фактори, включени в модела, бяха върнати като силно значими, което вероятно е ефект от много големия размер на извадката

Перспективи и значение

К. Р. Уайт е бъдещ сътрудник на австралийския научен съвет (проект № FT130101493).