Допринесе еднакво за тази работа с: Ренато Ферети, Матиас Москейра

високо

Роли Концептуализация, куриране на данни, официален анализ, разследване, методология, администриране на проекти, надзор, валидиране, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отдел по анатомия, Институт по биология на Ботукату, Държавен университет в Сао Пауло - ЮНЕСП, Ботукату, Сао Пауло, Бразилия

Роли Формален анализ, разследване, методология

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Свързана лаборатория по физическа активност, метаболизъм и здраве, Centro Universitario Adventista de Sao Paulo, Hortolandia, Сао Пауло, Бразилия

Роли Формален анализ, разследване, методология

Authors ‡ Тези автори също допринесоха еднакво за тази работа.

Отдел по анатомия, Институт по биология на Ботукату, Държавен университет в Сао Пауло - ЮНЕСП, Ботукату, Сао Пауло, Бразилия

Концептуализация на роли, надзор

Катедра по морфология и основна патология, Медицински факултет на Юндиай - FMJ, Jundiai, Сао Пауло, Бразилия

Концептуализация на роли, надзор

Affiliation Escola Superior de Educação Física — ESEF, Jundiai, Сао Пауло, Бразилия

Роли Формален анализ, методология, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Отдел по анатомия, Институт по биология на Ботукату, Държавен университет в Сао Пауло - ЮНЕСП, Ботукату, Сао Пауло, Бразилия

Роли Формален анализ, администриране на проекти, надзор, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Свързана лаборатория по нервно-мускулна пластичност, магистърска програма по наука за човешкото движение, Universidade Metodista de Piracicaba, Piracicaba, Сао Пауло, Бразилия

Допринесе еднакво за тази работа с: Ренато Ферети, Матиас Москейра

Роли Концептуализация, куриране на данни, формален анализ, методология, администриране на проекти, надзор, валидиране, визуализация, писане - оригинален проект, писане - преглед и редактиране

Свързана кардио-вентилаторна мускулна физиологична лаборатория, Институт по физиология и патофизиология, Университетска болница Хайделберг, Хайделберг, Германия

  • Ренато Ферети,
  • Eliezer Guimarães Moura,
  • Веридиана Карвальо дос Сантос,
  • Едуардо Хосе Калдейра,
  • Марсело Конте,
  • Синтия Юрий Мацумура,
  • Адриана Пертил,
  • Matias Mosqueira
  • Публикувано: 4 октомври 2018 г.
  • https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199728
  • >> Вижте препринта

Фигури

Резюме

Цитат: Ferretti R, Moura EG, dos Santos VC, Caldeira EJ, Conte M, Matsumura CY, et al. (2018) Диетата с високо съдържание на мазнини потиска положителния ефект от добавката на креатин върху функцията на скелетната мускулатура чрез намаляване на протеиновата експресия на IGF-PI3K-AKT-mTOR път. PLoS ONE 13 (10): e0199728. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0199728

Редактор: Гилермо Лопес Луч, Университет Пабло де Олавиде, ИСПАНИЯ

Получено: 4 юни 2018 г .; Прието: 23 септември 2018 г .; Публикувано: 4 октомври 2018 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията и нейния поддържащ информационен файл (таблица S1).

Финансиране: Авторът (ите) не получи финансиране за това произведение.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Обучението за устойчивост като едно стратегическо лечение на физическата рехабилитация срещу затлъстяване води до повишен капацитет за генериране на сила, подобрена мускулна маса и положителни ефекти върху свързаните със затлъстяването промени в скелетните мускули [8]. Тази техника увеличава експресията на IGF-1, която при мишката намалява експресията на миозин 2В и увеличава експресията на миозин 2Х, докато при хората има регулиране на бързо междинния 2Х миозин и регулиране на бързо междинния миозин 2А [2 ].

Материали и методи

Грижи и използване на животни

Четиридесет мъжки плъхове Wistar (HanUnib; Rattus novergucis) са получени от размножителната колония в Държавния университет в Кампинас (CEMIB-UNICAMP) и се поддържат от институцията ни за грижа за животните. Плъховете се държат в колективни клетки (2-3 животни на клетка) при постоянна температура (21 ± 2 ° C), цикли от 12 часа светлина/12 часа тъмнина и със свободен достъп до храна и вода. Всички процедури с животни са извършени в съответствие с Ръководството за грижи и употреба на лабораторни животни. Експерименталните протоколи бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните на FMJ (процес номер 490/2012).

Експериментални групи

По време на експериментите всички животни са на възраст 24 седмици и са рандомизирани в следните осем експериментални групи според диетата, обучението и добавката на креатин: i) нетренирана (UT) стандартна диета (SD; n = 5), ii ) нетрениран креатин (SD-CrM; n = 5), iii) тренировка за устойчивост (SD-T; n = 5), iv) тренировка за устойчивост с добавка на креатин (SD-T-CrM; n = 5), v) нетренирана диета с високо съдържание на мазнини (СН; n = 5), vi) нетренирана СН с добавка на креатин (HF-CrM; n = 5), vii) Трениране за СН и устойчивост (СН + Т; n = 5) и viii) СН и устойчивост обучение с добавка на креатин (HF-T-CrM; n = 5).

Животните от SD, SD-CrM, SD-T и SD-T-CrM са получили стандартна диета (Nuvital, Nuvilab, Бразилия), съдържаща 71 g въглехидрати, 23 g протеин, 6 g обща мазнина и 5 g фибри, на обща стойност 3,8 kcal/g. Осем седмици преди началото на експериментите и през осемте седмици експериментални процедури, групите плъхове със затлъстяване (HF, HF-CrM, HF-T и HF-T-CrM) са получавали диета с високо съдържание на мазнини (Nuvital, Nuvilab, Бразилия ), съдържащи 38 g въглехидрати, 15 g протеин, 46 g обща мазнина и 5 g фибри, общо 5,4 kcal/g. По време на експерименталния период животните имаха свободен достъп до вода и чау. Добавянето на CrM (300 mg/kg/ден) се дава ежедневно чрез сонда от 1-ви ден до последния ден от експерименталната процедура.

Протокол за обучение на съпротива

Количествен анализ на обучението

Максималният товарен товар се определя от общото количество товар, пренасян до горната част на стълбата. Общото изотонично свиване, измерено в грамове, се изчислява чрез сумиране на телесното тегло и вдигнатото тегло до върха на стълбата, умножено по броя на повторенията (колко пъти плъхът успешно се изкачва до върха на стълбата). Изчислена е работа, измерена в кило джаули (KJ), умножавайки общата маса, повдигната до върха на стълбата, дължината на стълбата (1,1 m), гравитационната сила (9,8 06 ms -2) и ъгъла на стълбата (sen80 ° = 0,9848).

Вземане на проби и подготовка на тъкани

След като плъховете почиват в продължение на 48 часа след последната сесия на катерене, те се упояват със смес от кетамин (80 mg/kg телесно тегло) и ксилазин (12 mg/kg телесно тегло), а левият и десният гастрокнемиус бързо се дисектират и един се замразява бързо в N-хексан, охлажда се в течен азот и се съхранява при -80 ° С. Замразените мускули бяха напречно напречно сечение (8-μm дебели криостатични секции) и след това оцветени с хематоксилин-еозин (HE) за хистологичен анализ, където минималният диаметър на влакното на Feret беше изчислен с помощта на софтуера Image J 1.51f (Национален здравен институт, САЩ). Използвахме минималния диаметър на Feret поради факта, че повечето от участъците бяха перпендикулярни на дългата ос на мускула и по този начин минимално отклонение от перпендикулярната дълга ос може да въведе артефакти в измерванията. Размерите на влакната от всяко експериментално състояние са определени от 5-7 случайно заснети изображения.

Определяне на нивата на протеин

Мускулни проби от втория гастрокнемий на всеки плъх бяха лизирани в пробен лизисен буфер, съдържащ прясно добавени протеаза и фосфатазни инхибитори (1% Triton X-100, 100 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM натриев пирофосфат, 100 mM NaF, 10 mM натриев орто-ванадий, 10 mM EDTA, 2 mM PMSF и 10 μg/ml апротинин). Пробите се центрофугират в продължение на 20 минути при 11 000 об/мин и разтворимата фракция се ресуспендира в 50 μl зареждащ буфер Laemmli (2% SDS, 20% глицерол, 0,04 mg/ml бромофенолно синьо, 0,12 M Tris-HCl, рН 6,8 и 0,28 М β-меркаптоетанол). Пробите се съхраняват при -80 ° С до анализа. Протеините се разделят на 8% -12% SDS-полиакриламидни гелове и се прехвърлят в нитроцелулозна мембрана. Първичните антитела се разреждат в TBS, съдържащ 0,05% Tween (TBS-T). Мембраните бяха инкубирани през нощта с първични антитела при 4 ° С (таблица S1). За вторична инкубация на антитела HRP срещу заек или срещу мишка (Promega) се разреждат в TBS-T, съдържащ 5% обезмаслено мляко (S1 таблица). Резултатите бяха визуализирани с подобрена хемилуминесценция (ECL) SuperSignal West Pico Chemiluminescent Substrate kit (Pierce Biotechnology). За контрол на натоварването с протеин, петна се отстраняват и повторно се сондират за глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH). Интензитетите на лентите са количествено определени с помощта на софтуера ImageJ 1.38X (Национален институт по здравеопазване, САЩ).

Статистически анализ

Всички статистически анализи бяха извършени с помощта на GraphPad Prism версия 6 за Windows, GraphPad Software, La Jolla California USA, www.graphpad.com. Използван е еднопосочен анализ за дисперсия (ANOVA) с многократно сравнение post hoc. Многократният тест за сравнение на Sidak е използван върху телесното тегло, епидидималната мастна маса, относителната мастна маса и нивата на протеини. Многократен несдвоен двустранен t тест на Student за двойно сравнение, използващ метода на Бенджамин и Хохберг и FDR (Q) = 5% е използван за максимално носещо натоварване, общо изотонично свиване, работа и относително натоварване. Непараметричен еднопосочен тест ANOVA Kruskal – Wallis е използван върху минимален диаметър на Feret. Значимостта се разглежда като p Фиг. 1. Ефект на диетата с високо съдържание на мазнини върху телесната маса на плъховете.

(A) Сравнение между стандартната диета (SD, (синя) и прилагането на диета с високо съдържание на мазнини (HF; червена) върху телесното тегло на плъхове (g) при нетренирани (UT) плъхове, обучени (T) плъхове, с креатин монохидрат) добавка (CrM) и при обучени плъхове с добавка на CrM (T-CrM). (B) Ефектът на HF диетата върху епидидималната мастна маса (g) на плъхове в сравнение със SD след третиране с UT, T, CrM и T-CrM. (C) Отговор на епидидималната мастна маса спрямо общото телесно тегло на високочестотна диета в сравнение със SD при лечение с UT, T, CrM и T-CrM. N = пет плъха във всяка група; * p-та до 8-та седмица, работата беше подобна на SD (Фигура 2C, таблица S7). За да се свърже промяната в мускулната физиология, наблюдавана при обучени плъхове, допълнени с CrM, ние разрязахме гастрокнемия в края на 8-та седмица от експеримента за анатомични анализи Първо, забелязахме, че размерът на мускулните влакна (минимален диаметър на Ферет, μm) се увеличава при обучени плъхове, допълнени с CrM (фиг. 2D). изведено върху гастрокнемиуса, хипертрофичният ефект на CrM върху обучени плъхове, измерващ разпределението на диаметъра на мускулните влакна, използвайки метода на минималния диаметър на Feret (Фигура 2Е).

(A) Максимално натоварване (g). (Б) Носене на товар, нормализирано спрямо телесното тегло (g/g). (C) Общо изотонично свиване (g). (D) Общо изотонично свиване, нормализирано спрямо телесното тегло (g/g). (E) Работа (KJ). (F) Работа, нормализирана спрямо телесното тегло (KJ/g). n = 5. * p nd до 8-та седмица на тренировка, мускулната ефективност при плъхове SD-T-CrM се подобрява значително, след като максималното натоварване се нормализира от телесното тегло (Фиг. 5В). Въпреки че анализите на общата изотонична сила (фиг. 5С), общата изотонична сила, нормализирана спрямо телесното тегло (фиг. 5D), работата (фиг. 5Е) и работата, нормализирана спрямо телесното тегло (фиг. 5F), показват, че SD-T CrM плъховете са имали по-добри ефективност, но това не е било значително в сравнение с HF-T-CrM плъховете.

(A) Максимално натоварване (g). (Б) Носене на товар, нормализирано спрямо телесното тегло (g/g). (C) Общо изотонично свиване (g). (D) Общо изотонично свиване, нормализирано спрямо телесното тегло (g/g). (E) Работа (KJ). (F), Работа, нормализирана спрямо телесното тегло (KJ/g). n = 5. * p Фигура 6. Имуноблотинг анализи на протеинова експресия на IGF-1-PI3K-AKT-mTOR път от гастрокнемиален мускул.

Протеиновите нива на GAPDH, показани в долната част на всеки имуноблот, бяха използвани за нормализиране чрез нивата на протеини на всеки имуноблот, показани в горната част. Показват се и се разделят три независими експеримента според обработката, обозначена с цветно кодирана лента; зелено представлява SD-T група, синьо представлява SD-T-CrM група, сиво представлява HF-T група и червено представлява HF-T-CrM група. (A) IGF-1. (B) IGF-1 рецептор β субединица. (C) IRS1 β субединица. (D) PI3K. (E) Фосфорилиран AKT. (F) Общо mTOR. (G) Фосфорилиран mTOR. (H) Съотношение фосфорилиран mTOR към общ mTOR. (I) S6K. n = 3. * p Фигура 7. Обобщение на ефекта върху протеиновите нива на гастрокнемиусния мускул на пътя IGF-1-PI3K-AKT-mTOR след 8 седмици тренировка за устойчивост и получаване на CrM, HF или HF-CrM.

Добавката на креатин монохидрат (CrM) повишава нивата на протеин на IGF1, IGF1-рецептор и фосфорилиран AKT. Това повишаване на нивата на протеин, насърчавано от добавките на CrM, би обяснило увеличаването на мускулната ефективност. Диетата с високо съдържание на мазнини (HF) и диетата с високо съдържание на мазнини, допълнена с CrM (HF-CrM) намаляват нивата на протеини на IGF1, IRS1, PI3K, фосфорилиран mTOR и HF-CrM също намаляват нивата на протеин на фосфорилирани SKT и S6K. Намаляването на нивото на протеини на тези ключови цели на пътя IGF-1-PI3K-AKT-mTOR би обяснило намалената мускулна ефективност.

Заключение

Демонстрирахме механизма, по който по време на тренировка за устойчивост CrM увеличава мускулния размер и мускулната ефективност, което предполага по-високо активиране на синтеза на мускулен протеин чрез IGF1-IRS1-PI3K-AKT-mTOR път. И обратно, високочестотната диета намалява мускулния размер и производителността чрез инхибиране на експресията на същия IGF1-IRS1-PI3K-AKT-mTOR път и този ефект не е отменен от добавянето на CrM. Тези резултати предполагат необходимостта от промяна на диетата преди, за да се усети ползата от тренировките за устойчивост и добавките на CrM.

Подкрепяща информация

S1 Фиг. Имуноблотинг анализи на протеинова експресия на фосфорилиран AKT (p-Akt-Ser473) от гастрокнемиален мускул.

Нивото на протеин на GAPDH, показано в долната част на имуноблот, беше използвано за нормализиране чрез нивата на протеин на pAKT, показани в горната част. Показват се и се разделят три независими експеримента според обработката, обозначена с цветно кодирана лента; зелено представлява SD-T група, синьо представлява SD-T-CrM група, сиво представлява HF-T група и червено представлява HF-T-CrM група. n = 3. Значимостта се счита за p-та седмица от експеримента.