Да се ​​изследват промените в чревната микробиота и метаболизма по време на развитието на неалкохолен стеатохепатит (NASH) при мишки, хранени с диета с дефицит на метионин-холин (MCD).

метаболома

Двадесет и четири мъжки мишки C57BL/6J бяха разделени по равно на четири групи и хранени с диета, достатъчна за метионин-холин, в продължение на 2 седмици (контролна група 2w, н = 6) или 4 седмици (контролна група 4w, н = 6) или диетата MCD за 2 седмици (група MCD 2w, н = 6) или 4 седмици (MCD 4w група, н = 6). Чернодробното нараняване, фиброзата и чревната бариерна функция бяха оценени след 2 и 4 седмици хранене. Фекалният микробиом и метаболом са изследвани с помощта на 16s rRNA дълбоко секвениране и газова хроматография-мас спектрометрия.

Мишките, хранени с MCD диета, представени с проста чернодробна стеатоза и леко влошаване на чревната бариера след 2 седмици. След 4 седмици хранене с MCD диета обаче, мишките развиха виден NASH с чернодробна фиброза и чревната бариера беше по-нарушена. В сравнение с контролната диета, диетата с MCD предизвиква постепенна дисбиоза на чревната микробиота, както е видно от значително намаляване на изобилието на Алистипес и (Eubacterium) копростанолигени група (P Безалкохолен стеатохепатит, диета с дефицит на метионин-холин, чревна микробиота, метаболом, безалкохолна мастна чернодробна болест

Основен съвет: Безалкохолният стеатохепатит (NASH) е все по-разпространен като забележителен проблем в световен мащаб. Увеличаването на доказателствата показва критичната роля на чревната микробиота в прогресията на NASH. Целта ни беше да изследваме динамичните промени в чревната микробиота и свързаните с нея метаболити по време на развитието на NASH при мишки, хранени с диета с дефицит на метионин-холин (MCD). За първи път откриваме, че диетата с MCD може да предизвика трайно влошаване на чревната микробиота и метаболома.

  • Цитат: Ye JZ, Li YT, Wu WR, Shi D, Fang DQ, Yang LY, Bian XY, Wu JJ, Wang Q, Jiang XW, Peng CG, Ye WC, Xia PC, Li LJ. Динамични промени в чревната микробиота и метаболома по време на развитието на дефицит на метионин-холин с диета, неалкохолен стеатохепатит. Свят J Gastroenterol 2018; 24 (23): 2468-2481
  • URL:https://www.wjgnet.com/1007-9327/full/v24/i23/2468.htm
  • DOI:https://dx.doi.org/10.3748/wjg.v24.i23.2468

Разпространението на неалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD), най-често срещаното хронично чернодробно заболяване в световен мащаб, се увеличава, обхващайки патологичен спектър от проста стеатоза до неалкохолен стеатохепатит (NASH) [1]. NASH е черен дроб, характерен за метаболитния синдром, отчитащ натрупването на липиди и чернодробното възпаление [2] и се очаква да бъде основният показател за чернодробна трансплантация през следващото десетилетие [3]. NASH обикновено се свързва с диабет тип 2, сърдечно-съдови заболявания и краен стадий на бъбречно заболяване [4, 5] и понастоящем не съществуват одобрени фармакологични терапии за NASH [6] .

Напоследък убедителни доказателства сочат критичната роля на чревната микробиота в патогенезата и прогресирането на NAFLD до NASH [7]. Обикновено микробиотата на коменсалните черва и гостоприемникът поддържат благоприятна симбиотична връзка. Черният дроб може да функционира като съдова защитна стена, медиирайки взаимност между гостоприемника и чревната коменсална бактерия [8]. Тази интимна връзка между стомашно-чревния тракт и черния дроб определя термина ос черва-черен дроб. Дисбиозата на чревната микробиота обаче увеличава притока на вредни вещества, като липополизахарид (LPS), етанол и бактериална ДНК, в черния дроб чрез циркулация в порталната вена и насърчава развитието на NASH [9, 10]. В момента ранната и неинвазивна диагностика на NASH с висока чувствителност и специфичност остава предизвикателна. Метаболомиката, заедно с други технологии „omics“, помага да се даде подробно разбиране на биохимичните събития, използвайки системния биологичен подход и улеснява ранната диагностика и използване на стратегии за лечение [11] .

Въпреки важността на чревната микробиота и метаболома в NASH, подробната информация относно тяхната роля по време на развитието на NASH е ограничена. Целта на настоящото изследване е да изследва динамични промени в чревната микробиота и метаболома по време на развитието на индуциран от диетата на метионин-холин (MCD) NASH в модел на мишка.

Протоколът за животните е създаден, за да сведе до минимум болката или дискомфорта на животните и е одобрен от Комитета за грижа за животните към Медицинското училище в Университета в Жеджианг (Номер на разрешение: 2017-591). Мъжки мишки C57BL/6J (на възраст 8 седмици) са закупени от лаборатория SLAC (Шанхай, Китай). След пристигането си мишките се аклиматизират за 1 седмица в специфична среда без патогени (23 ° C, 12 h/12 h светло/тъмно, 50% влажност и ad libitum достъп до храна и вода) преди експерименти. Мишките бяха хранени с диета, достатъчна за метионин-холин (Research Diet, Ню Брунсуик, САЩ) в продължение на 2 седмици (контролната група 2w, н = 6) или 4 седмици (контролната група 4w, н = 6). Алтернативно, мишките са били хранени с MCD диета (Research Diet) в продължение на 2 седмици (групата MCD 2w, н = 6) или 4 седмици (групата MCD 4w, н = 6). Спецификациите на диетата са обобщени в допълнителна таблица 1. След 2 или 4 седмици на диетата мишките бяха евтаназирани чрез интраперитонеална инжекция от 4% хлоралхидрат (с 1 mg/100 ml атропин, за инхибиране на дихателната секреция) за събиране на тъкани.

Фекални проби се събират от всички мишки при дефекация и се съхраняват при -80 ° C за по-нататъшни процедури. Кръвните проби се центрофугират (3000 rpm, 15 min) за серумно разделяне и всички серумни аликвотни части се съхраняват във фризер -80 ° C. Пробите от черния дроб и дебелото черво бяха фиксирани или в неутрално буфериран формалин, или в среда, вградена в оптимална температура на рязане (OCT) за хистологично оцветяване, или бяха замразени бързо в течен азот и държани във фризер -80 ° C за допълнителни процедури.

Вградените в парафин чернодробни секции бяха оцветени с хематоксилин-еозин (HE) или трихром на Masson’s за откриване на чернодробно увреждане или фиброза. Оцветените секции бяха сканирани с помощта на система за цифрова патология NanoZoomer (Hamamatsu Photonics, KK, Япония), която сканира цифрово секциите в определен формат на изображението за по-нататъшна оценка. Оцветените с HE участъци бяха оценени в съответствие със системата за оценка на активността на NAFLD (NAS) (оценка 0-2: Не NASH, 3-4: Граничен NASH и 5-8: NASH) [12]. Шест полета от всяка секция бяха избрани и анализирани при увеличение 200 ×. Трихромно оцветените срезове на Masson бяха анализирани, за да се определи количествено фиброзата, използвайки софтуера Image-Pro Plus (версия 6.0, Media Cybernetics, Rockville, САЩ), както е описано по-рано [13]. За всяка секция синята зона (колаген) се нормализира до червената зона (хепатоцит). Индексът на фиброза (%) се изчислява като процент от общата тъканна област и представлява средната стойност на шест произволно избрани полета от всяка секция.

Замразените чернодробни секции, фиксирани в OCT (10 μm), бяха оцветени с маслено червено O (Sigma-Aldrich, Сейнт Луис, МО, САЩ). Изображенията са заснети с помощта на гореспоменатата система за цифрова патология NanoZoomer. За количествено определяне на интрахепаталното натрупване на липиди, средната оптична плътност на червения интензитет беше оценена с помощта на софтуера Image-Pro Plus.

Съдържанието на триглицериди в черния дроб (TG) беше определено с помощта на търговски комплект от Applygen Technologies Inc. (Пекин, Китай) съгласно протоколите на производителя, а крайните концентрации на TG бяха нормализирани до съответното съдържание на протеин.

Парафиновите вградени чернодробни секции бяха оцветени за F4/80 (антиактивен макрофаг) (Abcam, Кеймбридж, Обединено кралство) и α-SMA (фиброзен белег) с процедури за оцветяване с имунохистохимия (IHC), както е описано по-рано [14]. Накратко, чернодробните секции бяха инкубирани със специфично първично антитяло, последвано от инкубация с хрянова пероксидаза (HRP), свързано вторично антитяло (Dako, Glostrup, Дания) и 3,3’-диаминобензидин; след това секциите бяха сканирани със системата за цифрова патология NanoZoomer. Използва се софтуер Image-Pro Plus за преброяване на клетки F4/80 + и количествен анализ на интензивността на оцветяването на α-SMA, както беше описано по-рано [13]. Шест зрителни полета бяха избрани на случаен принцип във всяка секция.

По същия начин вградените в парафин участъци на дебелото черво бяха оцветени за Zonula occludens-1 (ZO-1) (отличителна черта на чревната бариера) (Proteintech, Rosemont, IL, САЩ) със стандартни процедури за оцветяване с имунофлуоресценция, както е описано по-рано [15]. Накратко, срезовете бяха инкубирани със заешко поликлонално ZO-1 антитяло, последвано от инкубация с конюгирано козе антитяшко заешко антитяло (Jackson ImmunoResearch, West Grove, PA, САЩ) и 4 ', 6-диамино-2-фенил индол (DAPI) и изображенията са заснети с помощта на конфокален микроскоп Zeiss LSM T-PMT (Zeiss, Йена, Германия).

Общо ДНК беше извлечено от фекални проби с мини комплект за бързо изпразване на ДНК на QIAamp (Qiagen, Валенсия, Калифорния, САЩ), следвайки ръководството на производителя. След определяне на концентрацията и целостта на ДНК е изградена библиотека за секвениране на ампликони въз основа на PCR-амплифицираните V3-V4 променливи области на 16s rDNA. След това, квалифицираните библиотеки бяха сдвоени в последователност на платформата Illumina MiSeq, съгласно процедурите на производителя. Данните от суровото секвениране бяха подложени на филтриране с помощта на софтуера Trimmomatic, FLASH и QIIME. След това чистите четения бяха групирани в оперативни таксономични единици (OTU), използвайки софтуер UPARSE с праг от 97%. Представителното четене от всяка OTU беше избрано с помощта на пакета QIIME [16]. Представителните OTU последователности са анотирани и класифицирани таксономично с помощта на Ribosomal Database Project (RDP) Classifier v.2.2, обучен на базата данни Silva версия 123 [17]. Методът с размер на ефекта на линейния дискриминант (LDA) (LEfSe) (http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/) е приложен за диференциране на таксони със статистическа значимост и биологична значимост [18] .

Контрол 2wMCD 2wКонтрол 4wMCD 4w
NAS0,17 ± 0,171,17 ± 0,17 a 0,33 ± 0,214,83 ± 0,31 c f j
Стеатоза0,00 ± 0,001,17 ± 0,17 b 0,33 ± 0,212,50 ± 0,22 c e j
Възпаление0,00 ± 0,000,00 ± 0,000,00 ± 0,001,17 ± 0,17 b e i
Балониране0,17 ± 0,170,00 ± 0,000,00 ± 0,001,17 ± 0,31
TG (nmol/mg протеин)179,41 ± 21,72592,88 ± 55,84 b 204,45 ± 6,76 д 731,60 ± 113,46 a h
ALT (U/L)19,33 ± 0,88413,83 ± 81,77 а 34,83 ​​± 2,64 b d 974,17 ± 163,00 a h
AST (U/L)105,50 ± 10,55327,33 ± 39,92 a 109,83 ± 11,91 d 749.677 ± 92.34 b d i

Както се очакваше, мишките от групата MCD 4w развиха виден NASH, както се доказва от голяма чернодробна стеатоза с лобуларно възпаление и балониране на хепатоцити в черния дроб (Фигура 1А, Таблица 1). Оцветяването с маслено червено и чернодробното количествено определяне на TG също разкрива, че натрупването на мазнини е значително увеличено в черния дроб на мишките, хранени с MCD диета за 4 седмици (групата MCD 4w) в сравнение с това при мишките, хранени с контролната диета за 4 седмици ( Контролна 4w група) (Фигура 1В и D, Таблица 1). F4/80 + клетъчната инфилтрация беше значително увеличена в MCD 4w групата в сравнение с тази в контролната 4w група (Фигура 1C и E). Освен това установихме, че мишките от групата MCD 4w показват индикации за чернодробна фиброза, включително перипортално и интерстициално отлагане на колаген (Фигура 2А и С). Имунохистохимичният анализ допълнително потвърди резултата ни: експресията на α-SMA протеин беше значително регулирана нагоре в групата MCD 4w в сравнение с тази в контролната група 4w (Фигура 2B и D). Чревната бариерна функция беше допълнително нарушена при мишки, хранени с MCD диета в продължение на 4 седмици, в сравнение с тази при мишките, хранени с контролната диета, както се разкрива от ZO-1 имунооцветяване (Фигура 3).

Диетата с MCD ясно променя конфигурацията на чревната микробиота. Не се наблюдават значителни разлики в алфа разнообразието между контролната и MCD групите след 2 и 4 седмици лечение, както се оценява от индексите Chao1, Shannon и Simpson (данните не са показани). Тези две групи обаче бяха ясно разделени в различни клъстери на 2 седмици (ANOSIM, P A: PCoA парцел на микробиотата на базата на непретеглена метрика UniFrac. Всеки символ представлява една проба (н = 6 на група). B-D: Най-разпространените таксони на ниво (B), семейство (C) и род (D). E: Кладограмата LEfSe представлява таксон, обогатен в групата Control 4w (зелено) и в групата MCD 4w (червено). Пръстените отвътре навън представляват таксономични нива от тип до род. Размерите на кръговете показват относителните нива на изобилие на таксоните. F: Дискриминационни биомаркери с LDA резултат> 4.8. MCD: Дефицит на метионин-холин.

За да се характеризират по-нататък отличителните филотипове в чревната микробиота на двете групи, беше извършен LEfSe анализ. Не са открити значителни разлики между групата MCD 2w и групата Control 2w. На 4 седмици обаче установихме, че MCD диетата повишава нивата на изобилие от Anaerotruncus, Билофила, SMB53, Клостридий, Анаероплазма, Turicibacter, Helicobacteraceae, Flexispira, и Бактероиди [LDA резултат (-log10)> 4.8] и намалява нивата на изобилие от Алобакулум, S24-7, Bifidobacterium, Adlercreutzia, Lachnospiraceae, Акермансия, Sutterella, Desulfovibrionaceae, Porphyromonadaceae, Парабактероиди, и Erysipelotrichaceae [LDA резултат (log10)> 4.8] (Фигура 4E и F).

Използвайки нецелена стратегия, ние изучихме фекалния метаболом, свързан с функционалните характеристики на чревния микробиом, и в крайна сметка бяха идентифицирани и количествено определени 322 метаболита.

Доколкото ни е известно, това е първото проучване, което демонстрира динамични промени в чревната микробиота и метаболома в експериментален модел на MCD, индуциран от диета стеатохепатит: Ние се опитахме да определим ключовите микробиота и метаболити, участващи в прогресията на NASH с течение на времето.

В заключение, диетата с MCD индуцира чревната микробиота и влошаване на метаболомите. Фундаменталните наблюдения на тези промени ще предоставят нова представа за свързаното с NASH чревно разстройство и терапиите, насочени към червата за NASH.

Допринасящата роля на чревната микробиота в патогенезата на неалкохолния стеатохепатит (NASH) е широко проучена.