Ефект на андрографолида върху експресията на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 в началния етап на атеросклероза при атерогенни диети, хранени с плъхове

Мохамед Юлис Хамиди 1,2 *, Фадил Оензил 3, Янвирасти 4 и Юфри Алди 5

експресията

1 Биомедицинска програма, Медицински факултет, Университет Andalas, Паданг, Индонезия.

2 Катедра по фармакология, Медицински факултет, Университет Риау, Пеканбару, Индонезия.

3 Катедра по биохимия, Медицински факултет, Университет Andalas, Паданг, Индонезия.

4 Катедра по анатомия, Медицински факултет, Университет Andalas, Паданг, Индонезия.

5 Катедра по фармакология и клинична фармация, Фармацевтичен факултет, Университет Andalas, Паданг, Индонезия.

Резюме

Да се ​​оцени ефектът на андрографолида върху експресията на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) в началния етап на атеросклероза при плъхове, индуцирана от атерогенна диета. Изследването е проведено върху 27 плъхове, разделени в 3 групи (n = 9). Група 1 получи стандартна диета. На група 2 беше дадена атерогенна диета с витамин D3 700 000 IU/kg през първия ден, последвана от 5% кози мазнини, 2% холестерол, 0,2% холева киселина и стандартна диета до 100% в продължение на 2 дни, за да се предизвика стадий на започване на атеросклероза. Група 3 получи атерогенна диета и се лекува с андрографолид 40 mg/kg. Проведено е имунохистохимично изследване за определяне на експресията на MCP-1. Анализ на данни с помощта на еднопосочен Anova, последван от post hoc тест. Резултатите показват, че експресията на MCP-1 в група 1 е 6,61 + 1,90, в група 2 беше 32,99 + 3,74, а в група 3 е 9,61 + 2.47. Имаше значителна разлика между група 3, лекувана с андрографолид 40 mg/kg в сравнение с група 2 (р 0,05). В заключение, андрографолидът може да инхибира експресията на MCP-1 в началния етап на атеросклероза при третираните с андрографолид плъхове. По този начин андрографолидът може да бъде потенциално лекарство против атеросклероза.

Ключови думи

Андрографолид; Атеросклероза; MCP-1; Атеросклероза

Hamidy M .Y, Oenzil F, Yanwirasti Y, Aldi Y. Ефект на андрографолида върху експресията на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 в началния етап на атеросклероза при атерогенни диети, хранени с плъхове. Biomed Pharmacol J 2019; 12 (3).

Hamidy M .Y, Oenzil F, Yanwirasti Y, Aldi Y. Ефект на андрографолида върху експресията на моноцитен хемоаттрактант протеин-1 в началния етап на атеросклероза при атерогенни диети, хранени с плъхове. Biomed Pharmacol J 2019; 12 (3). Достъпно от: http://biomedpharmajournal.org/?p=28367

Въведение

Атеросклерозата е хронично възпалително заболяване, което се появява в стените на кръвоносните съдове. В патогенезата на атеросклерозата участват различни процеси, включително инфилтрация на възпалителни клетки, пролиферация на гладкомускулни клетки, увеличаване на извънклетъчния матрикс и образуване на тромб 1. Възпалението има важна роля и е основният механизъм в основата на патогенезата на атеросклерозата 2. Това възпаление възниква чрез взаимодействието между моноцитите и клетките, намиращи се в стените на артериите като ендотелни клетки и съдови клетки на гладката мускулатура 3 .

Моноцитите играят съществена роля в началния етап на атеросклероза 4. При ранни атеросклеротични лезии в интимата на кръвоносните съдове може да се открие натрупване на моноцити/макрофаги. Макрофагите натрупват холестерилови естери, което води до образуване на пяна 1. Различни съществуващи проучвания показват важната роля на моноцитния хемоаттрактант протеин-1 (MCP-1) в процеса на набиране на моноцити/макрофаги 5. Моноцитният хемоаттрактант протеин-1, член на семейството на С-С хемокини, има мощна хемоаттрактантна активност за моноцити/макрофаги 6. Този хемокин е силно експресиран в богатата на макрофаги зона на атеросклеротичните лезии при хора, както и при експериментални животински модели 5. Тези открития предполагат, че моноцитният хемоаттрактант протеин-1 има важна роля в началния етап на атеросклероза.

Разработването на антиатеросклерозни лекарства може да се извърши чрез изследване на противовъзпалителни лекарства, които действат по-конкретно, като влияят върху патогенезата на атеросклерозата. Една от съставките, която има противовъзпалителен ефект и потенциално като анти-атеросклероза, е андрографолидът, основната активна съставка, съдържаща се в Andrographis paniculata. Проведените проучвания доказват, че андрографолидът има противовъзпалителен ефект 7,8,9 и потенциал за развитие като анти-атеросклероза 10 .

Това проучване има за цел да оцени андрографолидния ефект върху експресията на MCP-1 в началото/ранния стадий на атеросклероза при плъхове, индуцирани от атерогенна диета.

Материали и методи

Експериментални животни

Двадесет и седем мъжки плъхове Wistar на възраст 10 седмици (150-200 g) са получени от Фармацевтичното училище към Университета в Риау. Плъховете се поставяха в клетки в добре проветриво помещение и се оставяха храна и вода ad libitum. Стайната температура беше 20–26 ̊C, а осветлението в помещението се регулираше светло и тъмно в продължение на 12 часа, последователно. Здравето на плъховете се наблюдаваше добре и клетките за плъхове се почистваха всеки ден. Аклиматизацията на плъховете се извършва в продължение на една седмица, преди да се използва в това проучване. Третирането на животни беше подложено на декларацията от Хелзинки. Етично одобрение е получено от Комитета за етичен преглед за изследвания в областта на медицината и здравето, Медицински факултет, Университет в Риау (№: 457/UN.19.5.1.1.8/UEPKK/2017).

Експериментален дизайн

Плъховете бяха разделени на случаен принцип в 3 групи (n = 9), на група 1 (нормален контрол) беше дадена стандартна диета. Група 2 (атерогенен контрол) получи атерогенна диета с витамин D3 (холекалциферол) 700 000 IU/kg (Sigma, Сейнт Луис, МО, САЩ) през първия ден, последвана от 5% козе мазнини, 2% холестерол, 0,2% холик киселина (Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ) и 92,8% стандартна диета за 2 дни, за да се предизвика стадий на започване на атеросклероза 11,12. Група 3 (лекувана група) получава атерогенна диета и се лекува с андрографолид 40 mg/kg (Andalas Sitawa Fitolab, Padang, Индонезия). Андрографолид се дава перорално веднъж дневно с помощта на стомашна сонда.

Оценка на началния етап на атеросклероза

Началният етап на атеросклероза се оценява въз основа на образуването на пяна. След приключване на лечението се използва етерна анестезия за умъртвяване на плъховете. Коремните аортни тъкани се изрязват бързо и се фиксират в 10% неутрализиран формалдехид в 0,1 М фосфатен буфер. Аортната проба е вградена в парафин. Извършихме оцветяване с хематоксилин и еозин (H&E), за да измерим броя на пенестите клетки в коремната аорта на плъховете. Клетките с пяна се изчисляват с увеличение × 400 при 9 зрителни полета. Изображенията са получени с помощта на светлинен микроскоп, оборудван с камера (Leica, Wetzlar, Германия) и свързан към компютърен монитор.

Имунохистохимично оцветяване

MCP-1 в коремната аорта на плъх бяха идентифицирани с използване на MCP-1 поликлонално антитяло (Bioss Antibodies Inc., Massachusetts, USA). Като положителен контрол се използва вграден в парафин миши бъбрек с положителен IHC за MCP-1. Слайдовете бяха наблюдавани с помощта на светлинен микроскоп при увеличение от 400 пъти. Снимките са направени с помощта на микроскопска камера (Leica, Wetzlar, Германия) до 10 снимки на всеки слайд. Експресията на MCP-1 в коремната аорта беше оценена от софтуера за анализ на изображения на Photoshop, за да се изчисли процентът на площ 12. Процентът на площта представлява площта за сравнение, съдържаща MCP-1 с цяло напречно сечение на аортата, което се приема за ширина на изразяване. Двама независими патолози бяха поканени да изследват слайдовете.

Статистически анализ

Данните са представени като средно ± SEM. За анализ на резултатите се използва еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA), последван от post hoc тест на Bonferroni. Р а), б)

Група 1: нормална контролна група; Група 2: атерогенна контролна група; Група 3: лекувана група.

Статистическият анализ на данните беше извършен с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и post hoc тест на Bonferroni за средно сравнение на SPSS 17.0.

Стойностите са представени като средни + SEM (N = 9).

Група 1: нормална контролна група; Група 2: атерогенна контролна група; Група 3: лекувана група.

Статистическият анализ на данните беше извършен с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ (ANOVA) и post hoc тест на Bonferroni за средно сравнение на SPSS 17.0.

Стойностите са представени като средни + SEM (N = 9).

а) Р б) Р 13,14. Доказано е, че Андрографолид използва противовъзпалителни ефекти при експериментални модели на респираторни възпалителни заболявания, включително астма 15, остро увреждане на белия дроб (ALI) 16 и идиопатична белодробна фиброза (IPF) 17. Доказано е, че андрографолидът предпазва от инсулт чрез инхибиране на производството на NADPH оксидаза 2 (NOX2) и производството на индуцируем азотен оксид (iNOS) чрез инхибиране на NF-kB 18 .

За да се развие андрографолидът като ефективно противовъзпалително лекарство, са проведени различни клинични проучвания, включително за лечение на синузит, където лекарството е докладвано за ефективно облекчаване на възпалителни симптоми и се понася добре от пациентите 19. Полезните ефекти на A. paniculata са показани във фаза 2 на ревматоиден артрит 20 и значително намаляват умората при пациенти с множествена склероза 21 .

Токсикологично проучване на андрографолид е проведено както доклинични, така и клинични проучвания. В проучване за остра токсичност беше установено, че андрографолид до 5 g/kg, прилаган перорално дневно в продължение на до 14 дни при плъхове, няма забележим неблагоприятен ефект. Същите резултати бяха открити и в проучване за субакутна токсичност, което показа, че прилагането на перорална доза андрографолид до 500 mg/kg, прилагана дневно в продължение на до 21 дни при плъхове, също няма забележим неблагоприятен ефект 22. В клинично изпитване е установено, че приложението на 170 mg пречистени екстракти от A. paniculata (около 85 mg андрографолид), прилагани перорално на всеки 12 часа в продължение на 12 месеца, се понася добре при пациенти с рецидивираща ремитираща множествена склероза. Само един пациент е получил A. paniculata с лек кожен обрив, който е смекчен с антихистаминово лечение 21 .

Етапът на започване на атеросклероза се провежда при плъхове, индуцирани от атерогенна диета. В това проучване използвахме плъхове като експериментално животно, тъй като тези животни имат няколко предимства, включително практични, лесни за получаване и са всеядни диетични животни, по-скоро като хората. Атеросклерозата може да бъде предизвикана при плъхове чрез добавяне на витамин D3 (холекалциферол) към диета с високо съдържание на холестерол 23. Модел на атеросклероза при плъхове, създаден от витамин D3 и хранене с атерогенна диета, е подобен на човешкия. Съставът на атерогенната диета, даден в това проучване, се състои от 5% козе мазнини, 2% холестерол, 0,2% коликова киселина и стандартна диета до 100% 12. Дадена е атерогенна диета за предизвикване на хиперхолестеролемия при опитни животни. Хиперхолестеролемията кара LDL да инфилтрира артериите, особено на мястото на хемодинамичното нарушение. Окислителните и ензимните модификации ще превърнат LDL в oxLDL 24. oxLDL причинява ендотелна дисфункция, така че ще предизвика набиране на моноцити в артериалната стена 25 .

Инфилтрацията на моноцити в артериалната стена играе важна роля в стадия на започване и развитието на атеросклеротична лезия. Един фактор, който играе важна роля при набирането на моноцити, е MCP-1 26. Различни видове клетки, представени в стените на кръвоносните съдове, синтезират и секретират MCP-1. Този хемокин има силен хемотаксичен ефект върху моноцити/макрофаги 27. Хемотаксичният ефект на MCP-1 върху моноцитите в циркулиращата кръв се медиира от специфичен високоафинитетен рецептор CCR2 4,5,26. Aiello et al демонстрират, че MCP-1 може да инициира атеросклероза при мишки с дефицит на аполипопротеин-Е 28. Междувременно проучвания върху мишки с делеция на MCP-1 или CCR2 показват намаляване на натрупването на моноцити в артериалната стена и предотвратяване образуването на атеросклеротични лезии 29,30 .

Тези доказателства доказват, че MCP-1 играе важна роля в етапа на започване на атеросклероза и може да бъде потенциална цел за атеросклеротична терапия.

Етапът на започване на атеросклероза се характеризира с образуването на пенообразуващи клетки 31. Клетките с пяна, открити в ранната атеросклеротична лезия, произхождат от моноцити в циркулацията 32. Моноцитите, които са се прикрепили към съдовите ендотелни клетки, след това мигрират в артериалния интимен слой, медииран от MCP-1 24. След това тези моноцити ще се диференцират в макрофаги в отговор на стимулиращия фактор на макрофагите-колонии (M-CSF) и други стимули 33. Макрофагите експресират рецептора за отстраняване (SR), състоящ се от CD36, SR-A и лектиноподобни oxLDL рецептори-1 (LOX-1), които улесняват усвояването на oxLDL частици от макрофаги, което води до наситени с липиди клетки от пяна 34 .

Предполагаме, че механизмът на инхибиране на MCP-1 от андрографолид възниква чрез инхибиране на активирането на NF-kB. Предишни проучвания показват, че андрографолидът има противовъзпалителни ефекти чрез инактивиране на NF-κB 13. NF-kB е транскрипционен фактор, който има важна роля в регулирането на гените на различни цитокини и хемокини, участващи в възпалителния процес 35. NF-kB се състои от: p105/p50 (NF-kB1), p100/p52 (NF-kB2), p65 (RelA), RelB dan c-Rel. Пътят NF-kB се активира от комплекса IKK (IkB киназа), който се състои от регулаторната субединица, IKKg, която е известна също като основен модификатор NF-kB (NEMO), и каталитичната субединица, IKKα и IKKb. Тъй като субстратът надолу по веригата е Ikbα. При нормални обстоятелства димерът NF-kB p50/NF-kB p65 е свързан с Ikbα. В отговор на стимули IKKα и IKKb ще бъдат фосфорилирани и ще предизвикат фосфорилиране на Ikbα. Фосфорилираният Ikbα ще се разгради по протеизомния път на убиквитин. Разграждането на Ikbα причинява NF-kB p50/NF-kB p65 да претърпи фосфорилиране и транслокация, което в крайна сметка води до генна транскрипция 36 .

Инхибирането на активността на NF-kB от андрографолид се осъществява чрез дефосфорилиране на p65 чрез активиране на PP2A 9,37. Дефосфорилирането на р65 от андрографолид води до намалена транслокация на NF-kB в ядрото и намалява свързването на NF-kB с ДНК 37. Чрез този механизъм андрографолидът инхибира експресията на MCP-1, така че да инхибира набирането на моноцити в артериалната стена.

Заключение

Резултатите от настоящото изследване предполагат, че андрографолидът има атеропротективни ефекти, като инхибира експресията на MCP-1 и в крайна сметка потиска образуването на макрофаги от пяна Клинично, представените тук резултати дават представа за потенциалното използване на андрографолид като антиатеросклеротично лекарство.

Благодарности

Авторите с признателност признават, че настоящото изследване се подкрепя от Министерството на научните изследвания и технологиите и висшето образование Република Индонезия.

Конфликт на интереси

Авторите декларират, че няма конфликт на интереси.

Източник на финансиране

Настоящото изследване се финансира от Министерството на научните изследвания и технологиите и висшето образование Република Индонезия (грант № 277/UN.19.5.1.3/PP/2018).