Таня Рейс

Катедра по медицина, Отдел по ендокринология, метаболизъм и диабет, Медицински факултет на Университета в Колорадо, Медицински кампус Аншуц, Аврора, Колорадо, Съединени американски щати

Замислени и проектирани експерименти: TR. Извършва експериментите: TR. Анализирани данни: TR. Реактиви/материали/инструменти за анализ, допринесени: TR. Написа хартията: TR.

Свързани данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Резюме

Взаимодействията между гените и диетите играят решаваща, но слабо разбрана роля за податливостта към затлъстяване. Съответно разработването на генетично подлежащи на проследяване модели на системи за изследване на влиянието на диетите в склонни към затлъстяване генетични среди е фокус на настоящите изследвания. Тук представям модифицирана синтетична диета дрозофила, оптимизирана за навременно развитие на ларвите, етап, посветен на съхранението на енергия. По-специално повишаването на нивата на отделни макронутриенти - въглехидрати, липиди или протеини - доведе до значително различни организмени ефекти. Диетата с високо съдържание на въглехидрати влияе неблагоприятно на времето за развитие, размера, ранната продължителност на живота и телесните мазнини. Поразително е, че четирикратното увеличаване на количеството диетични липиди няма нито един от тези ефекти. Диетите, богати на протеини, изглеждат най-полезни, тъй като ларвите се развиват по-бързо, без промяна в размера, до възрастни възрастни. Вярвам, че тази синтетична диета значително ще улесни изучаването на взаимодействията между гените и диетите в енергийния баланс на организма.

Въведение

Степента на затлъстяване е висока и продължава да се покачва. Очевидно има генетични фактори, но също така знаем, че хранителните тенденции допринасят за развитието на болестта. Разработени са множество животински модели, за да се опитаме да разберем по-добре появата и развитието на затлъстяването и произтичащите от него метаболитни нарушения, сложността на които представлява дълбоки предизвикателства пред изследванията. Взаимодействията между гените и диетите (т.е. как генетичният фон влияе върху реакцията на индивида към дадена диета) са още по-сложни, илюстрирани от трудността при предвиждането на резултатите от интервенционните диети [1]. Като цяло диетичните компоненти, считани за важни за управлението на теглото, са липиди, въглехидрати и протеини. Манипулирането както на относителните, така и на абсолютните количества на тези компоненти в диетите на моделните организми води до различни ефекти върху телесното тегло, телесните мазнини, общия метаболизъм и дълголетието, наред с други биологични параметри [1]. Въпреки това, едновременното променяне на генетичния фон за идентифициране на основните молекулярни пътища е осъществимо само при модели, подлежащи на безпристрастни генетични екрани.

маса 1

a Витамини, минерали и нуклеинови киселини

b Желиращ агент

c Консерванти и др.

d Средна продължителност на живота за жените.

д „n.d.“, не е определено.

f Средата на Hunt е получена от „дефинираната“ среда на Sang, но използва отделни аминокиселини вместо казеин.

g Въз основа на хранителното съдържание на отделните съставки, предоставено от техните производители; вижте уебсайта на Bloomington Stock Center (http://flystocks.bio.indiana.edu/Fly_Work/media-recipes/bloomfood.htm).

В това проучване разработвам синтетична диета дрозофила, при която ларвите се развиват със скорости, близки до тези, наблюдавани при богати диети. Определям ефектите върху развитието, размера, общите нива на телесните мазнини, поведението при хранене и продължителността на живота на нарастващите нива на специфични макронутриенти (въглехидрати, липиди или протеини). При богата на въглехидрати диета ларвите имат повишени триацилглицериди (TAG), развиват се по-бавно в по-малки какавиди и като възрастни показват промени в свързаната с възрастта смъртност. За разлика от това, при богата на протеини диета, ларвите не натрупват допълнителни TAG и се развиват по-бързо, без промяна в размера, в сравнение с техните контроли на братя и сестри, хранени с нормална диета. Тези открития подчертават изискването за балансирано хранене за оптимално развитие, растеж и продължителност на живота.

Материали и методи

Fly запаси и отглеждане

Първоначално мухите от тип Wild Oregon R са получени от Блумингтънския център за стоки (запас # 4269) и се поддържат в лабораторията от няколко поколения. Възрастните мухи бяха оставени да снасят яйца върху плочи с гроздов сок с дрождова паста при 25 ° за 4-6 часа. 24 часа след излюпването, 50 ларви от първа възраст се прехвърлят във всеки флакон със синтетична среда. Всички експериментални животни се държат в 25 ° инкубатор.

Синтетична хранителна среда

99% идентични; по този начин продуктът съдържа 87–94% протеин, чийто аминокиселинен състав е

99% дефинирани. Средата се автоклавира в продължение на 30 минути, като се използва течен цикъл и Tegosept се добавя само след автоклавиране. За да се предотврати утаяването на казеин, средата се разбърква при охлаждане и преди изливане.

Измервания на триглицериди и протеини

25 ларви на Oregon R от всяко експериментално състояние се хомогенизират в микроцентрифужна епруветка с помощта на пестик и се центрофугират в продължение на 5 минути при 13 200 об/мин. 8 μl супернатант се прехвърлят в прясна епруветка и отново се центрофугират в продължение на 5 минути при 13 200 об/мин. 5 μl от тази проба бяха използвани в TAG анализа, използвайки комплект за триглицеридни реактиви (Sigma, T2449), съгласно инструкциите на производителя. 1 μl проба се използва в комплекта за анализ на протеини II (BioRad, 500–0002), както се препоръчва от производителя. Нивата на TAG са нормализирани до нива на разтворим протеин. За всяко експериментално състояние бяха проведени три независими анализа (по 25 ларви всяка). За извършване на статистически тестове е използван софтуер Graphpad Prism v6.

Нил Червено оцветяване

Ларвите бяха обърнати, за да изложат мазнини, и фиксирани с 8% параформалдехид (Electron Microscopy Sciences, 15710) за 45 минути. Разчленените мастни тела се промиват три пъти в PBTriton 0,1% и се оцветяват с 0,25 μg/ml Nile Red (Molecular Probes, N1142) в PBS за 30 минути. След трикратно измиване в PBTriton 0,1%, мазнини бяха монтирани на предметни стъкла в монтажни среди SlowFade (Molecular Probes, S36936), за да се намали фото избелването. Изображенията са получени с помощта на конфокален микроскоп.

Измервания на размера

Какавидите от ларви, отглеждани по посочените диети, бяха измерени с помощта на шублер. 54 какавиди бяха измерени за всяко експериментално състояние. Софтуерът Graphpad Prism v6 е използван за извършване на Обикновен еднопосочен ANOVA тест.

Скорости на еклозия

Стойностите на еклозията са измерени за всеки флакон като продължителността (в дни) до първите възрастни, извадени от кученцата. Стойностите се записват ежедневно сутрин и вечер. Най-малко 230 животни (7 флакона с

50 животни) са анализирани за всяко експериментално състояние.

Прием на храна

Приемът на храна от ларви се измерва, както е описано по-рано [3], с изключение на това, че ларвите, отглеждани в експерименталните диети, са били изложени за 30 минути на същата диета, към която е добавено оцветено багрило. Бяха проведени три независими теста за общо 60 животни на експериментално състояние, а софтуерът Graphpad Prism v6 беше използван за извършване на обикновен еднопосочен ANOVA тест.

Анализ на продължителността на живота

Ларвите, посяти на специфични диети, се оставят да се затварят за 24 часа и след това да се чифтосват за 48 часа. Женските са прехвърлени в пресни флакони от същата диета, на която са отглеждани. Смъртните събития се записвали ежедневно. Най-малко 300 мухи са анализирани на експериментално състояние, като се използва софтуер Graphpad Prism v6 за извършване на статистически анализ (Log-rank (Mantel-Cox) и Gehan-Breslow-Wilcoxon тестове). Мухите се прехвърляха във флакони с прясна среда на всеки 2-3 дни. Старите флакони се съхраняват и животните, излизащи от яйца, които са били положени в тях, се оценяват за оценка на плодовитостта.

Резултати

Като първа стъпка към дисектиране на ролята на диетичния състав в енергийния баланс на организма, разработих обогатени диети, базирани на рецепта за синтетична храна за мухи [16] (вж. Материали и методи). „Определената“ среда на Sang за култура на дрозофила предизвиква значителни закъснения в развитието - до 2 дни закъснение в блуждаенето на ларвите в сравнение с лабораторни храни и ниски нива на еклозия (данните не са показани). Забелязах, че увеличаването на концентрацията на който и да е компонент от определената от Sang диета (т.е. въглехидрати, липиди или протеини) ускорява развитието на ларвите и увеличава скоростта на еклозия (непубликувани наблюдения). Съответно предположих, че всеки от тези компоненти е донякъде ограничаващ в „дефинираната“ диета на Sang, и тествах модифицирани рецепти, в които концентрациите на всички съставки бяха увеличени в различна степен (1,33 до 2,67 пъти) спрямо оригиналната рецепта. Тези среди бяха с по-твърда консистенция поради намалената концентрация на вода, така че намалих концентрацията на желиращ агент (агар) (Таблица 1). Открих, че докато ларвите се развиват най-бързо при диета с 2,67 пъти повече захароза и 2 пъти повече от другите компоненти, при диета с

1,75 пъти повече захароза и

1,33 пъти повече от останалите компоненти (Таблица 1) продължителността на скитането е сравнима с тази на меласа/дрожди на основата на храна и скоростите на еклозия са най-високите (данните не са показани и вижте по-долу).

След това специално увеличих относителното изобилие на липиди, въглехидрати или протеини и наблюдавах ефектите върху различни параметри на енергийната хомеостаза при ларви и възрастни. Ларвите от първи тип (L1) от див тип са отгледани на четири различни диети: нормална (N) и производни на N, при които концентрацията на определен макронутриент-липиди (4L), въглехидрати (4C) или протеин (4P) е нараснала четирикратно . Ембрионите се събират върху гроздови плочи, оставят се да се излюпват и L1 се прехвърлят в съответната среда и се оставят да се развиват до скитащи или възрастни етапи.

специфични

Ларвите са хранени с балансирана (N), богата на въглехидрати (4C), богата на липиди (4L) или богата на протеини (4P) диета. (A-C) Екстракти от ларви са анализирани за (A) общо TAG, (B) общ разтворим протеин или (C) общ TAGs, нормализиран за разтворим протеин. (D) Мастните тела на ларвите бяха оцветени след фиксацията за специфичната за мазнините боя Nile Red (червена). Мастните тела на ларвите, отглеждани в диети 4C и 4L, имат по-високи нива на мазнини на клетка (стрелка) и обикновено показват „изтичане“ на мазнини от изолираната тъкан (главата на стрелката). Звездичките показват значителни разлики (P 0,05) между диетите, докато коригираният с Welch t тест установява значение само за сравнението N-to-4C (P = 0,0218).

Подобно на други животни, плодовите мухи показват хранителни предпочитания въз основа на вкуса [20], които могат да бъдат значително променени от диетичния състав. Освен това някои диети могат да предизвикат по-лесно сигнали за ситост, отколкото други диети. Повишеното съдържание на мазнини, наблюдавано при животни, хранени с богата на въглехидрати диета, може по този начин да отразява увеличаване на диетичния прием или, алтернативно, увеличено съхранение на диетична енергия. Измерих консумацията на храна в ларви. Ларвите, които се бяха излюпили при експерименталните диети, бяха изложени за 30 минути на същата диета, към която беше добавено оцветено багрило [3]. Чрез измерване на количеството оцветител на храна в личиновия хомогенат [3] открих тенденция към намаляване на храненето за животни, хранени с богата на Р диета, но тази разлика не беше статистически значима (Фигура 2). Тези открития са в съответствие с резултатите от проучвания в други системи, при които съдържанието на протеини в диетата изглежда предизвиква сигнали за ситост [10, 21, 22]. Не са наблюдавани разлики между количествата храна, приети при N, 4C или 4L диета (Фигура 2). Липсата на големи разлики в консумацията на храна от ларви предполага, че поведението при хранене има най-малко малък принос за наблюдаваните метаболитни промени в ларвите, хранени при различните диети (Фигура 1).

Животните, отглеждани по посочените диети, имаха право да се хранят с червено оцветена храна за определен период от време. Количеството червен оцветител за храна в хомогенат се измерва като абсорбция при 520 nm. 20 ларви на диета са анализирани след 30-минутен период на хранене на посочената синтетична диета. Няма значителни разлики, наблюдавани от обикновената еднопосочна ANOVA. Ленти за грешки, стандартно отклонение.

(А) Продължителността (в дни) от снасянето на яйца до еклозията на възрастни мухи при посочените диети. Извършени са 7 независими експеримента (общо ≥ 230 животни на експериментално състояние). (B) Средните стойности в (A) бяха извадени от средната продължителност, измерена на N диета. (В) Мухите (n = 54 на условие), отглеждани при различните диети, се оставят да се развиват до етапите на какавидите, като по това време се използва шублер за измерване на дължината на тялото им. Звездичките показват значителни разлики (P Фиг. 4А). Мухите, хранени с диета 4С, показват необичайно бимодално разпределение на продължителността на живота, съставено от краткотрайно население и дълголетно население (Фигура 4В). Не се наблюдава разлика между N и 4L диети. Сравнявайки N и 4P диетата обаче установих, че мухите започват да умират по-късно при 4P диета, със средна продължителност на преживяемост с два дни в сравнение с N диета (Фиг. 4) и статистически значима разлика в общата преживяемост (Gehan-Breslow -Wilcoxon Test P = 0.0013). При дрозофила и повечето други видове размножаването ограничава продължителността на живота, представлявайки очевиден „компромис“ [27]. По-специално, наблюдавах дали нови възрастни животни са затворени във флаконите, в които мухите са снесли яйцата си за период от 2-3 дни, и не открих видими разлики в плодовитостта между никоя от тези синтетични диети (данните не са показани).

Дълголетие на възрастни мухи, хранени с посочените диети. n≥352 на диета. (А) Криви на оцеляване. Тестът Log-rank (Mantel-Cox) показва, че кривите са значително различни (P = 0,0048). Средна продължителност на живота (дни); N, 63; 4С, 69; 4L, 63; 4P, 65. (B) Хистограми на индивидуална продължителност на живота.

Дискусия

Проучванията, фокусирани върху енергийния метаболизъм на дрозофила, често използват обогатени диети, създадени чрез добавяне на специфични съставки към неопределена диета. Този подход има значителни ограничения. Например в системите за бозайници способността да се тестват различни съотношения на въглехидрати към мазнини често изисква намаляване на нивата на една съставка под количеството, открито при „стандартна“ диета, като същевременно се поддържат стандартни нива на други съставки [28]. Въпреки че все още не съм изследвал ефектите от намаляването на хранителните компоненти, диетите, описани тук, улесняват този вид подход при дрозофила.

Освен това е невъзможно да се определи крайната концентрация на даден хранителен компонент, когато дадена съставка просто се добави към неопределена диета. В модел на дрозофила на сърдечно-съдови заболявания, предизвикани от диета, съдържанието на липиди в диетата се увеличава чрез добавяне на кокосово масло, богата на липиди (недефинирана) съставка [9]. Минимални ефекти върху организма се наблюдават при концентрации под 30% кокосово масло [9]. Като се има предвид, че успях да повиша четири пъти съдържанието на липиди в диетата, без да има забележими неблагоприятни ефекти върху продължителността на живота или времето за развитие, може да се изчисли, че за да се постигнат видовете промени, наблюдавани при „с високо съдържание на мазнини“/„с високо съдържание на липиди“ ”Диети, базирани на 30% кокосово масло, съдържанието на липиди в диетата трябва да се увеличи значително повече от четири пъти и/или добавеният източник на липиди трябва да съдържа по-големи пропорции на специфични молекули, насърчаващи съхранението (например TAG). Диетите с високо съдържание на мазнини/високо съдържание на липиди в човешките популации е малко вероятно да постигнат обогатяване на мазнини от този мащаб.

Проучвания с недефинирани диети установяват, че увеличаването на пропорционалния калориен принос от дрождите произвежда постни мухи, докато когато същият брой калории се осигурява предимно от захар, триацилглицеридите се увеличават [10]. Установено е също, че съотношението дрожди: захароза е важно за оптималната продължителност на живота, тъй като увеличаването на това съотношение намалява продължителността на живота [10, 23], но увеличава плодовитостта [10]. Нещо различно от протеина само по себе си в диетичните дрожди трябва да бъде съответният компонент по отношение на това съотношение, тъй като моята 4P диета увеличи продължителността на живота, въпреки високото съотношение протеин: захароза. Въпреки това, повишеното дълголетие при диета с високо съдържание на протеини и ниско съдържание на въглехидрати също не изглежда да съответства на последните открития с мишки [29] и хора [30]. Изобилието на отделни аминокиселини е доказано от други, че има важен принос за дълголетието [31], и по този начин също е важна променлива, която трябва да се има предвид при бъдещи изследвания. Например, казеинът в отчетените тук диети може да бъде заменен със специфични комбинации от отделни аминокиселини.

Необичайното бимодално разпределение на продължителността на живота при възрастни, хранени с 4С, може да отразява две групи индивиди: една популация се е поддала на неблагоприятните ефекти от повишените мазнини, преживени по време на развитието и ранния живот на възрастните, докато други, които са оцелели достатъчно дълго, са могли да се възползват от някои стари специфични за възрастта предимства на допълнително съхраняваната енергия. Всъщност последните проучвания при хора показват, че хранителните изисквания се променят значително с възрастта [30].

В заключение, диетите, описани тук, предлагат допълнителна опция за анализ на макронутриентните ефекти върху различни параметри на метаболизма на организма при дрозофила.

подкрепяща информация

S1 Фиг

Яйца, снесени на 20 женски, през интервал от 4 часа. За всяка диета данните представляват три независими колекции от яйца, всяка от две независими популации от възрастни (на възраст 8–10 дни). Звездичките показват значителни разлики (P (40K, jpg)

Благодарности

Бих искал да благодаря на Iswar Hariharan и лабораторията Hariharan, където тази работа започна, и Michael McMurray за помощта при редактирането на ръкописа.

Отчет за финансиране

Тази работа беше подкрепена от безвъзмездни средства от Националните здравни институти (1F32DK077401 и NIDDK K01DK095932) и Американската сърдечна асоциация (12BGIA11930014).

Наличност на данни

Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.