Резюме

Предшестващо състояние/Цел: Мишката Mdr2 -/- развива ранен хроничен холестатичен хепатит и хепатоцелуларен карцином (HCC) при възрастни. Тествахме ефектите от диета с ограничено количество калории върху развитието на HCC при мишки Mdr2 -/-. Материали и методи: Mdr2 -/- мишки (n = 40, разделени на две групи от по 20 мишки всяка) бяха рандомизирани, за да получат диета ad libitum или диета с ограничено съдържание на калории. Две мишки от всяка група бяха умъртвени на 3 и 6 месеца и пробите от чернодробна тъкан бяха отстранени за анализ. Останалите мишки са хранени със съответните си диети до навършване на 30-месечна възраст, като по това време те са евтаназирани и черният дроб е събран за анализ. Резултати: Диетата с ограничени калории има частичен химиопрофилактичен ефект върху развитието на HCC при мишки Mdr2 -/-. Освен това, мишките с диета ad libitum са имали средна преживяемост от 361 дни, докато групата с ограничени калории е имала средна преживяемост от 500 дни (p = 0,0001). Заключение: Ограничената диета може да намали шанса за развитие на HCC при пациенти в риск и може да увеличи защитното действие на противовъзпалителните агенти.

Хепатоцелуларният карцином (HCC) е значителен здравословен проблем, а хроничното възпаление е основен рисков фактор за развитието на HCC. Вирусът на хепатит С (HCV) е един от основните етиологични агенти на HCC: той предизвиква хронично възпаление на черния дроб и е отговорен за повишената честота на HCC в западните страни (1-3). Възпалителният процес допринася, ако не и причина, за голямо разнообразие от новообразувания и се изчислява, че до 15-20% от всички смъртни случаи са свързани с това явление (4-6). Въпреки че връзката между хроничната имунна активация и развитието на рак е известна отдавна, едва наскоро механизмите, лежащи в основата на това явление, са разгадани (3-8). Най-честите причини за чернодробно възпаление, водещо до HCC, освен вирусни инфекции, са метаболитни нарушения, включително затлъстяване (9, 10).

Моделите на мишки на HCC се използват широко за изследване на молекулярните механизми на първичен рак на черния дроб (11-18) и наскоро беше показано, че повечето миши HCC имат много прилики с човешкия си колега (11). В това проучване изследвахме потенциалната защитна роля на нискокалоричната диета срещу HCC при мишки Mdr2 -/-, модел на HCC, свързан с възпалението (11-18). Mdr2 -/- мишките нямат двата алела на АТР-свързващата касета подсемейство B1 ген. Това води до липса на специфичен за черния дроб Р-гликопротеин, отговорен за транспортирането на фосфатидилхолин през жлъчно-каналикуларната мембрана, и индуцира портално възпаление в ранна възраст (3 месеца). Това е последвано от бавно развиващ се HCC (над 12-месечна възраст) (12). По-точно, липсата на фосфолипиди в жлъчката води до регургитация на жлъчката и портално възпаление, последвано от развитие на хепатоцитна дисплазия и HCC (19, 20).

В това проучване предположихме, че хипокалоричната диета леко ще отслаби оксидативния стрес, произведен от изтичане на жлъчка или чрез вторична инфилтрация от възпалителни клетки. За да проверят тази хипотеза, мишките Mdr2 -/- бяха разпределени в една от двете групи: редовна диета или ограничена диета. Наблюдавахме началото на хроничния хепатит и евентуалния му преход към явно развитие на HCC при мишки Mdr2 -/- чрез ултразвук и след жертва хистопатологично изследване на чернодробните тъкани.

ефекти

Ултрасонографският външен вид на черния дроб на мишките Mdr2 -/- в различни часови точки. О: Нормален черен дроб на 3 месеца в групата (хипокалорична диета). Счита се, че черният дроб има нормална ехогенност и архитектура. B: Леко до умерено фибротичен черен дроб в групата, хранена с нормална диета с мишка. Може да се наблюдава минимално намаляване на обема с неравномерни полета. Малки хипоехогенни области предполагат първоначална фиброза. Снимки, направени след 3 месеца С: Умерено до тежък фибротичен черен дроб в групата, хранена с диета ad libitum. Очевидни са намален обем на черния дроб с по-очевидни признаци на фиброза. D: Неопластични чернодробни възли в черния дроб от мишка от групата, хранена по желание със стандартна диета за мишки. Подобен външен вид на тежко фиброзния черен дроб с добавяне на множество слабо ехогенни възлови лезии.

Материали и методи

Ултрасонография. Ултрасонографски изследвания бяха извършени с мишки в гръбначна легнало положение при силна седация, използвайки комбинация от тилетамин-золазепам и ксилазин, инжектирани интрамускулно. Ултрасонограф на General Electric Vividi (Scill Veterinary Products, Бергамо, Италия) с 8 L сонда беше използван с ултразвуков гел, за да увеличи максимално предаването на ултразвук от един от авторите (FM). Ултрасонографските изследвания се повтарят на всеки 2 месеца до приключване на експериментите, като се оценява големината на черния дроб, броят и размерът на чернодробните лезии и наличието на коремен излив.

Изобразени са типичните патологични особености, наблюдавани в черния дроб на мишки, хранени с диета с ограничено съдържание на калории (панели А и В) и тези, хранени с диета ad libitum (панели С и D). О: Лимфоидната инфилтрация, ограничена до порталния тракт, без некроза на чернодробните клетки, е показана със стрелки (първоначално увеличение × 20). Б: Дукталната пролиферация на билиарното дърво е показана със стрелка (оригинално увеличение × 10). В: Видими са обширни мастни промени с големи вакуоли мазнини в хепатоцитите (първоначално увеличение × 20). D: Хепатоцелуларен карцином, съставен от чернодробни клетки с атипична ядрена цитология и ненормално архитектурно разположение (първоначално увеличение × 10).

Хистология. Изрязаните проби от биопсия бяха фиксирани в 10% буфериран формалин и вградени в парафин. Секции от 5 μm бяха оцветени с хематоксилин-еозин и хематоксилин-vanGieson, оценявайки тежестта на чернодробното увреждане и наличието и степента на неопластична трансформация.

Статистически анализ. Общото време на преживяемост (OS) се изчислява като период от датата на диагностициране на HCC до смърт от каквато и да е причина, в който момент данните са цензурирани. OS беше определена по метода на Kaplan-Meier за ограничаване на продукта (21). Разликата по отношение на ОС според различни променливи е оценена чрез log-rank тест (22).

Граничната точка за данните за оцеляване беше март 2009 г. За статистически анализ беше използван софтуерът SPSS (версия 13.05; SPSS, Чикаго, Илинойс, САЩ). Счита се, че р-стойност по-малка от 0,05 показва статистическа значимост.

Крива на оцеляване на Каплан-Майер за двете миши кохорти. Средната продължителност на преживяемостта за кохортата, хранена ad libitum chow, е била 361 дни (сива линия), докато тази за кохортата, получавала диета с ограничени калории, е 500 дни (черна линия). Тази разлика е статистически значима (p = 0,0001).

Резултати

Двете групи проявяват различна тенденция по отношение на наддаването на тегло, като контролната група показва тенденция към по-големи тежести, която е по-очевидна в края на периода на наблюдение. По това време групата с ограничена диета е имала средно тегло от 27 g, докато контролите са имали средно тегло от 35 g. Последователното наблюдение и събиране на органи разкрива прогресиращ хепатит и в двете групи, което е значително по-изразено в групата, хранена със стандартна чау.

Ултразвуковото изследване показа много по-големи органи с дифузна ехогенност, предполагаща чернодробна фиброза. Значително по-малка ехогенност се наблюдава в черния дроб на групата, хранена с диета ad libitum, предполагаща по-ниска степен на фиброза. Тези лезии са се развили към нодуларни регенеративни възли и множество неопластични нодуларни лезии, характеризиращи се с променлив диаметър, ниска разделителна способност и лоша ехогенност. Черният дроб проявява тенденция към намаляване на обема, с неясни граници; архитектурата на органите беше очевидно нарушена от прогресията на болестта. Схемите на ехогенния външен вид на Mdr2 -/- мишки по различно време са обобщени на Фигура 1.

Характерните патологични характеристики, наблюдавани в черния дроб на Mdr2 -/- мишки на 3-месечна възраст, бяха: портално възпаление с възпалителна клетъчна инфилтрация и развитие на фиброза, пролиферация на дукта и мастна промяна. По-късно мишките развиват единичен или мултифокален HCC. Тези патологични характеристики са по-забележими в кохортата на диалитите ad libitum и се отразяват както в броя, така и в размера на лезиите (Фигура 2). Мишките започнаха да развиват HCC по различно време в двете групи: групата с неограничена диета започна да показва чернодробни тумори преди 16-месечна възраст според сегашната литература, от друга страна, животните, хранени с ограничена диета, развиха HCC по-късно в живота си ( след 16 месеца). Освен това ултрасонографията показа по-бързо прогресиране на заболяването в кохортата с неограничена диета. По-важното е, че освен забавянето на появата и прогресирането на HCC, диетата с ограничени калории води до по-добро цялостно състояние на мишките. Това се превърна в удължено време за оцеляване. Статистическото изследване на Каплан-Майер дава средно време на оцеляване за групата с диета ad libitum от 361 дни, докато групата на диетата с ограничени калории има средна продължителност на оцеляване от 500 дни (p = 0,0001). Фигура 3 показва кривата на оцеляване на Каплан-Майер за двете експериментални групи.

Дискусия

Изглежда, че възпалението играе ключова роля в много подгрупи на HCC (1-7, 20). Mdr2 -/- мишките осигуряват брилянтен модел за обобщаване на клиничните и патологични характеристики на това заболяване. Всъщност този модел рекапитулира ключови характеристики на човешкото заболяване, включващо хронично възпаление, геномни аномалии и фиброза, със своите късни развития: цироза и микрохепатика (11-19, 23). Приехме този модел, за да изследваме възможната защитна роля на нискокалоричната диета върху патологичната каскада, която започва с чернодробно възпаление, в крайна сметка в резултат на HCC.

Забелязахме, че от ранното начало на хроничния хепатит на 3-месечна възраст, специалната диета води до по-бавно появяване и прогресиране на това явление, както е показано при физикален преглед, ултразвуково изследване и хистопатология. Интересното е, че този защитен ефект е не само незабавен, но и траен, както се вижда от гореспоменатите изследвания и от времето на операционната система на мишките, хранени с хипокалоричната диета. Освен това открихме по-малка степен на чернодробна фиброза, цироза и микрохепатика. Проблемът с превенцията в случай на HCC е предизвикателен, тъй като много фактори играят роля при това заболяване при хората, включително: инфекция с хепатит С, чернодробно възпаление (множество етиологии), злоупотреба с алкохол, богата на мазнини диета и излагане на канцерогени ( 24-29). Няколко публикации посочват причиняващата и увековечаващата роля на мазнините в няколко модела миши хепатит, освен това е добре известно, че затлъстяването е рисков фактор за множество заболявания при хората, някои от тях с неопластичен характер (30, 31).

Възпалителните промотори индуцират производството на реактивни кислородни видове, което води до окисляване и увреждане на ДНК и увреждане на възстановяването на ДНК (4-8). В допълнение, някои резултати предполагат възможно окислително състояние при Mdr2 -/- мишки, когато възпалението им стане хронично (11, 12, 16, 32). В обобщение, не е изненадващо, че хроничното възпаление и вторичната чернодробна фиброза могат да бъдат модулирани чрез подходяща диета (33-35).

В заключение установихме, че диетичните ограничения през целия живот на мишките Mdr2 -/- намаляват тежестта на хепатита и забавят появата на HCC на възраст 16 месеца. Въпреки че разработването на нови, надеждни лекарствени терапии за лечение на HCC и спиране на прогресията до рак на хроничен хепатит е жизненоважно, въпреки това намесата в начина на живот е задължителна при пациенти с риск от развитие на HCC. Въпреки идентифицирането на подходящи противовъзпалителни терапии при пациенти с хроничен хепатит с риск от развитие на HCC, други стратегии, насочени към профилактика на този вид рак и подобряване на общата смъртност, са еднакво важни в борбата срещу това коварно заболяване (36 ).

Бележки под линия

Конфликти на интереси

Нито един от авторите няма конкурентни интереси по отношение на това изследване.