Обобщение

Контракциите на матката са важни за благосъстоянието на жените. Въпреки това, патологично повишената контрактилитет може да доведе до дисменорея, особено при по-млади жени. Тук описваме прост ex vivo препарат, позволяващ бърза оценка на ефикасността на релаксантите на гладката мускулатура, които могат да се използват за лечение на дисменорея.

Резюме

Въведение

Като основен женски орган, матката е от решаващо значение за размножаването и е от съществено значение за храненето на плода 1. Матката се състои от три слоя: периметриум, миометриум и ендометриум. Миометриумът е основният контрактилен слой на матката и играе ключова роля в раждането на плода. Ендометриумът е най-вътрешният слой, покриващ маточната кухина, и е от съществено значение за имплантирането на ембриона. При небременните жени в репродуктивна възраст ендометриалният слой се отделя ежемесечно в началото на менструалния цикъл. Миометриумът помага в този процес на отделяне, като поддържа спонтанните миометриални контракции, необходими за изчистване на некротичната ендометриална тъкан от матката 1 .

За съжаление, повишената контрактилитет на миометриума може да доведе до негативни странични ефекти като дисменорея или болезнени менструални спазми. Това се наблюдава особено при млади жени и жени, които не раждат 2. Дисменореята обаче е различна за всяка жена и зависи от силата на миометриалните контракции; по-силните контракции често са свързани с усещането за силни спазми 3. Контрактилитетът на миометриума може да се визуализира с помощта на ултразвук на матката и често се разпознава като ендометриални вълни. Счита се, че засиленото освобождаване на простагландини по време на менструация 4 в матката, подложена на разтрошаване на ендометриума, допринася за повишена хиперконтрактилитет на миометриума, което води до исхемия и хипоксия на маточния мускул и по този начин увеличава болката 3 .

Тежката дисменорея може да попречи на ежедневната активност на някои жени и 3 до 33% от жените имат много силна болка, което може да доведе до това жената да бъде прикована за легло за 1 до 3 дни всеки менструален цикъл 5. Дисменореята е водещата причина за гинекологична заболеваемост при жени в репродуктивна възраст, независимо от възрастта, националността и икономическия статус 5. Очакваното разпространение на дисменорея е както високо, така и вариращо, като варира от 45% до 93% при жените в репродуктивна възраст 5. Болката, свързана с дисменорея, оказва влияние върху ежедневието на жените и може да доведе до лошо академично представяне при подрастващите, по-ниско качество на съня, ограничаване на ежедневните дейности и промени в настроението 5 .

Много жени, които изпитват тежка дисменорея, прибягват до лекарства без рецепта, за да облекчат болката си. Такива лекарства без рецепта съдържат инхибитори на циклооксигеназа (COX), които предотвратяват образуването на простагландини 6. COX инхибиторите обаче са свързани с неблагоприятни сърдечно-съдови събития и около 18% от жените с дисменорея не реагират на тези инхибитори 7. Следователно, има нужда от нови лекарства за намаляване на менструалните спазми. Тъй като прекомерността на матката допринася за патогенезата на дисменорея, една от възможните стратегии може да бъде използването на маточни релаксанти.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Протокол

Всички процедури с животни са одобрени от Институционалния комитет за грижа и употреба на животните към Медицинското училище в Индиана (Индианаполис, Индиана). В проучването са използвани 2-5-месечни F2-129S-C57BL/6 полово зрели женски мишки.

ВНИМАНИЕ: Осигурете безопасност, като носите лабораторно палто, маска и ръкавици при работа с животни и биологично опасни материали.

1. Подготовка на разтвора

  1. Пригответе буфер на Krebs, който съдържа: 130 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl2, 1,2 mM NaH2PO4, 0,56 mM MgCl2, 25 mM NaHCO3 и 5 mM глюкоза, рН 7,4. Непрекъснато оксидирайте буфера на Krebs със смес от сгъстени газове, съдържащи 5% CO2 и 95% O2, като същевременно поддържате температурата на буфера на 37 ° C, използвайки циркулираща водна баня.
  2. Пригответе фосфатно-буфериран физиологичен разтвор на Dulbecco (DPBS), който съдържа: 2,68 mM KCl, 1,47 mM KH2PO4, 136,89 mM NaCl и 8,1 mM Na2HPO4, рН 7,4.

2. Подготовка на животни

  1. Анестезирайте мишки, използвайки инхалация на изофлуран (3%) с отпадъчни газове. Осигурете адекватна анестезия, като оцените рефлексите за отнемане. Притиснете задния пръст, за да потвърдите, че не се предизвикват движения, което показва загуба на рефлексни реакции. След постигане на дълбока упойка, евтаназирайте животното чрез обезглавяване.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Изофлуран може да причини разширяване на гладката мускулатура. Следователно, препаратът за репродуктивния тракт трябва да се измие обилно и да се инкубира в буфера на Krebs в продължение на поне 15-30 минути преди започване на експериментите ex vivo. Изофлуранът може да причини дразнене и дискомфорт, когато е в контакт с кожата, затова действайте внимателно.
  2. Поставете тялото на голяма лодка за претегляне, облицована с хартиена кърпа.
    ЗАБЕЛЕЖКА: Бременните женски лабораторни служители не трябва да участват в експерименти с изофлуран, тъй като той може да намали теглото на плода, да намали вкостеняването на скелета на плода и да увеличи риска от спонтанен аборт 8,9. Вдишването на CO2 може да се използва като заместител на евтаназията на мишките.

3. Определяне на етапа на естросния цикъл

  1. С малки форцепс повдигнете клитора, за да получите достъп до вагиналната устна и бавно вкарайте микропипетен връх, съдържащ 10 µL DPBS във влагалището.
    1. Уверете се, че върхът на микропипетата е вкаран през устието под ъгъл 10 - 30 °, за да се избегне пробиване на вагиналната стена. Течността все още трябва да се вижда на върха след поставянето. Ако течността не се вижда, върхът е вкаран твърде много във влагалището и парацервикалната област на влагалището може да е била перфорирана.
    2. Леко издърпайте вагиналните устни мускули с върха на микропипетата, за да позволите на въздуха да излезе от влагалището.
  2. Бавно изплакнете вагиналната кухина, като пипетирате нагоре и надолу 2-3 пъти с 10 µL DPBS и поставете изтеглената клетъчна суспензия върху предметно стъкло.
  3. Използвайте контрастен микроскоп с обърната фаза, за да определите етапа на естралния цикъл чрез цитологичен анализ. Процедурата се извършва, както е описано на други места 10, 11. Уверете се, че клетъчната суспензия не изсъхва, преди да може да се извърши цитологичен анализ. Суспензията може да се разрежда със свеж DPBS, ако е необходимо.

4. Дисекция на репродуктивния тракт на мишката

5. Образуване на тъкани

6. Анализ на данни

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.

Представителни резултати

Фигура 1 показва представителни изображения, направени по време на цялата процедура за изолиране на репродуктивния тракт, която е описана в този протокол. За да избегнем замърсяването на буфера с козина, което би намалило качеството на видеото, ние навлажнихме тялото на мишката със 70% етанол. Основният ориентир за секцията за дисекция на протокола е намирането на пикочния мехур. Матката и влагалището ще бъдат разположени по-ниско от пикочния мехур.

За да тестваме протокола, лекувахме целия репродуктивен тракт с епинефрин. Известно е, че епинефринът причинява релаксация на гладката мускулатура на матката. Този хормон се произвежда ендогенно в надбъбречната медула и служи като хормон на стреса при бозайниците. В нашите експерименти използвахме 1 µM епинефрин. Това е насищаща концентрация, за която е известно, че причинява максимален отговор 12. Проведена е поредица от четири експеримента. Във всички проучвания 1 цМ епинефрин обратимо инхибира спонтанно подвижността на матката (Фигура 2).

За да определим количествено спонтанната подвижност на репродуктивния тракт, ние проектирахме алгоритъм, който ни позволява да оценим средната скорост на промяна в евклидовото разстояние между две избрани точки на репродуктивния тракт на мишката. Позициите на точките се проследяват с помощта на модула за проследяване на движението на софтуера MATLAB. Съответният скрипт за MATLAB, който използвахме за изчисляване на евклидовите разстояния, е предоставен в Допълнителни материал на линия. Позицията на точките е критична за успешна процедура за проследяване на движението. Трябва да се обмисли внимателно качеството на видеоклиповете, тъй като отраженията на светлината от стената на чашата на Петри могат да отвлекат вниманието на инструмента за проследяване на движението и да спрат движението на клаксона, докато пренасочват точката към едно от отраженията на светлината. Решихме да поставим една от точките в средата на рог, за да се уверим, че е достатъчно далеч от отраженията на стената на Петри. Втората точка обикновено се избира във влагалището, тъй като тя не проявява спонтанна подвижност. Фигура 3 предоставя извадка от анализ на данни и Допълнителна фигура 1 показва представителните изображения, получени по време на проследяване на движението.

метод

Фигура 1: Стъпки на изолация на целия репродуктивен тракт. (A) Направен е разрез на кожата и коремно-тазовата област е изложена над перитонеума (1). (Б.) Серозната мембрана се отваря бавно, за да изложи стомашно-чревния тракт (2). (° С) Стомашно-чревният тракт е преместен, за да изложи маточните рога (3). Пикочният мехур (4) може да се визуализира близо до съединението на рогата. (д) Маточните рога са освободени и са направени разфасовки по страничните страни на срамната симфиза (5), за да се разкрие вагината (6). (Е.) Отстраняване на изолирания репродуктивен тракт и поставяне в разтвор на DPBS. Всички излишни косми или съединителна тъкан бяха отстранени. (F) Дълбоко вдлъбнатина може да се види на влагалището (вдясно) след отстраняване на ректума (вляво, 7). (G) Околната съединителна тъкан се отстранява. Използван е цифров фотоапарат и софтуер Application Suite (версия 3.7.0) за получаване на изображения в реално време по време на дисекцията (настройка на камерата: нюанс 20/наситеност 80). Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.


Фигура 2: Показан е представителен експеримент с целия изолиран репродуктивен тракт. Изображенията са правени на разстояние 15 s преди (A), по време на (Б.), и след (° С) прилагането на 1 цМ епинефрин. Препаратът за репродуктивен тракт показа висока подвижност в панели А и С в отсъствието на епинефрин, но е в състояние на покой в ​​панел В с присъствието на 1 цМ епинефрин. Нередактираните видеозаписи се предоставят като Допълнителни видеоклипове 1-3. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Дискусия

Тук описахме метод за оценка на спонтанната контрактилитет на целия репродуктивен тракт на гризачи, който включва яйчниците, яйцепровода, маточните рога и вагината. Използвахме подобен метод, за да демонстрираме релаксиращия ефект на фенилефрин върху спонтанната подвижност на матката 13, но в миналото не успяхме да предоставим количествен анализ на данните. В тази работа разработихме алгоритъм за количествен анализ на данните за подвижността, използвайки модула за проследяване на движението MATLAB. Това е полезна техника за тестване на нови лекарства, които регулират контрактилитета на матката, независимо дали лекарствата отпускат или свиват гладката мускулатура на матката. Основно предимство на този модел е, че репродуктивният тракт е непокътнат, запазвайки всички вътрешни вътрематочни клетъчни взаимодействия. За отбелязване е, че този протокол не изисква специално оборудване. Изолирането на матката може да се извърши с обикновена лупа и не се изисква никакво сложно оборудване за видеозапис. Ако цифрова камера с висока разделителна способност не е налична за изображения, като алтернатива може да се използва камера за личен мобилен телефон.

Най-критичната стъпка от протокола за оценка на подвижността на репродуктивния тракт е получаването на жизнеспособна маточна тъкан. Миометриумът в маточните рога е подвижният елемент на репродуктивния тракт. Ето защо, по време на изолацията е важно да се избягва преразтягане или компресиране на рогата. Също така е важно да се гарантира, че маточната тъкан е добре оксидирана по време на експеримента, за да се поддържа подвижността на матката. Най-добрият начин за предотвратяване на каквито и да било увреждания на маточните рога е да се осъществи контакт само със съседната съединителна тъкан, докато се почиства матката или се премества репродуктивният тракт. Тъй като влагалището не се свива спонтанно по време на експеримента, приемливо е да се компресира с форцепс при преместване на репродуктивния тракт от едно ястие в друго. Целите експерименти с репродуктивния тракт могат да се извършват заедно с изометрични записи на напрежение, които оценяват индуцираната от окситоцин контрактивност на матката преди или след натоварване. Телният миограф обаче е скъпо оборудване, което не винаги е на разположение в обща лабораторна среда.

Установихме, че оптималният възрастов диапазон за женски мишки е 2-5 месеца. Посочихме, че анестезията с изофлуран може да доведе до намалена подвижност и може да са необходими допълнителни измивания, за да се предотврати това усложнение, предизвикано от изофлуран. Алтернативно, човек може да използва въглероден диоксид за евтаназия на мишки. Ако възникнат трудности по време на дисекцията, фокусът върху ориентири, като пикочния мехур, може да помогне. За да определим количествено получените данни за подвижността, използвахме софтуера MATLAB. Основният проблем с проследяването на движението в MATLAB беше, че тракерът не успя да намери правилно рогата, когато се придвижваха близо до стената на чашата на Петри. Adobe Premier Element е използван за изрязване на видеозаписите и за намаляване на размера на видео файловете. Въпреки че е изключителен софтуерен пакет, той не винаги може да бъде достъпен в типична лабораторна обстановка. Алтернативен вариант може да бъде използването на модула за безплатно проследяване на движението на софтуера ImageJ или дори проста ръчна оценка на изображения, направени с еднакви интервали, и сравняване на положението на маточните рога върху сегментиращата решетка. Фигура 2 показва пример за проста оценка на спонтанната подвижност на матката и включва сравнение на движенията на репродуктивния тракт в рамките на 15 s интервал.

Досега не се съобщава за прост метод за оценка на подвижността на матката в условията на Петри. Ултразвукови и вътрематочни сензори за налягане могат да се използват за наблюдение на свиваемостта на човешката матка 14. Трудно е обаче да се проучат основните механизми в непокътнатата човешка матка. Следователно, използването на животински модели за изследване на спонтанна контрактилитет на матката е важно. Женският репродуктивен тракт показва спонтанни миометриални контракции, които са от решаващо значение за благосъстоянието на жената, включително нейната плодовитост и раждане 15. Тези контракции могат да бъдат визуализирани като ендометриални вълни по време на ултразвуково изследване. Въпреки това, по време на менструация, прекомерната контрактилитет на матката може да създаде дискомфорт и да доведе до дисменорея или менструални спазми. За облекчаване на някои симптоми на дисменорея са необходими нови лекарства, насочени към отпускане на гладката мускулатура на матката. Нашият прост метод предоставя начин за оценка на ефектите на различни съединения върху контрактилитета на матката.

Необходим е абонамент. Моля, препоръчайте JoVE на вашия библиотекар.