Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

флавоноидният

Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

Национална ключова лаборатория за генетично подобряване на културите, Селскостопански университет Huazhong, Ухан, Хубей, Китай

  • Джафу Тан,
  • Маоджун Уанг,
  • Лили Ту,
  • Yichun Nie,
  • Йонджун Лин,
  • Xianlong Zhang

Фигури

Резюме

Цитат: Tan J, Wang M, Tu L, Nie Y, Lin Y, Zhang X (2013) Флавоноидният път регулира цветовете на венчелистчетата на памучното цвете. PLoS ONE 8 (8): e72364. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0072364

Редактор: Джинфа Джанг, Държавен университет в Ню Мексико, Съединени американски щати

Получено: 11 май 2013 г .; Прието: 16 юли 2013 г .; Публикувано: 12 август 2013 г.

Финансиране: Тази работа беше подкрепена с безвъзмездна помощ от Националната програма за научни изследвания и развитие на високите технологии на Китай (Програма 863, номер на безвъзмездна помощ 2012AA101108). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Разнообразието от цветове на цветята е един от най-красивите дарове на природата и служи като универсален инструмент за растителните биохимици, генетици и еколози. Различните цветни цветове са съставени от различни пигменти и ко-пигменти. Беталаините, каротеноидите и антоцианините са трите основни, добре характеризирани групи пигменти [1]. Флавонолите, pH и йоните също играят важна роля при определянето на цвета на цветята [2], [3], [4]. В допълнение към ендогенните генетични ефекти, факторите на околната среда като светлина и температура също могат да бъдат отговорни за цвета на цветята [5], [6], [7], [8]. В допълнение към общия си фенотип, цветът предоставя и цветя с различни биологични функции, като защита срещу UV-светлина и привличане на опрашители [9], [10]. В рамките на едно цвете цветовите промени по време на развитието на цветята са широко разпространени в покритосеменните растения [11], [12]. Многобройни проучвания показват, че въпреки че е важно за взаимодействието на опрашителите, механизмът на промяна на цвета на цветята преди и след синтеза не е добре разбран [13], [14], [15].

Тук представяме данни, получени чрез биологичен анализ, показващи, че цветът на памучното цвете се състои предимно от флавоноиди. Промяната в цвета е свързана с експресията на флавоноидни гени, особено тези, участващи в биосинтезата на антоцианин. Светлината играе важна роля в натрупването на пигменти и биосинтеза на флавоноиди, но присъщ фактор съществува и във флавоноидния път по време на развитието на цветята.

Материали и методи

Растителни материали

Материалите са събрани от експерименталното поле на Хуаджунг аграрен университет, Ухан, Китай. Не са необходими конкретни разрешения за тези местоположения или дейности. Той не включва застрашени или защитени видове. Памучните растения, използвани в това проучване, Gossypium hirsutum YZ1, F3H стабилна тиха линия на YZ1 (f3h), която е генерирана от нашата лаборатория [46], кафяв памук G. hirsutum T586 и G. barbadense 3-79, са култивирани с стандартни земеделски практики и управление. Цветята бяха събрани в типичен слънчев ден през август в различни часови точки, вариращи от деня преди цъфтежа до деня след цъфтежа. Денят на синтеза е отбелязан като 0 DPA. Отбелязани са различни точки от времето според времето в Пекин (GMT +8). Цветя в шест времеви точки, включително 6, 11 и 12 ч., 15 и 18 ч. На 0 DPA и 6 сутринта на 1 DPA, бяха събрани за анализ. Прашникът и плодниците бяха внимателно отстранени, за да се избегне замърсяване. След това цветята се изрязват на нивото на границата на чашелистчето, претеглят се или веднага се смилат на прах в течен азот или се потапят в течен азот и се съхраняват при –70 ° C до употреба.

Анализ на памучна зародишна плазма

За да се събере информация за памучното цвете, бяха консултирани различни ресурси за зародишна плазма в Интернет. Две от тях, Китайската информационна система за ресурси за зародишни зародиши (CGRIS) (http://icgr.caas.net.cn/#) и Националната система за зародишни зародиши (GRIN) (http://www.ars-grin.gov /npgs/searchgrin.html), съдържащи изобилие от данни за памучни листенца, бяха посочени за анализ. Няколко представителни снимки на памучно цвете са получени от Интернет (включително http://www.learnnc.org/lp/multimedia/9447, http://commons.wikimedia.org/wiki/File:Darwins-cotton-flower.jpg, http: //www.photostuff. org/galapagos3.html, http://www.alohafriendsphotos.com/flowers2.html).

Количествено определяне на антоцианините

Венчелистчетата се претеглят и смилат в течен азот, всяко цвете се счита за индивидуална проба. Антоцианините се екстрахират от цветята в кисел (1% HCl [w/v]) метанол за 48 h. Екстракцията се извършва със съотношение 10 ml буфер към 1 g проба. Антоцианинът се определя количествено чрез измерване на абсорбцията при 530 nm [47]. За всяка проба бяха използвани повече от пет цветя за анализ.

Фотография и управление на изображения

Цветята бяха събрани от експерименталното поле и незабавно заснети с цифров фотоапарат. Цветя, събрани в една и съща точка от времето, бяха взети на една снимка и във всеки момент от времето бяха използвани идентични параметри на фона и камерата. Снимките на цветя, направени в различни моменти от време, бяха комбинирани в едно изображение с Adobe Photoshop 7.0.

Третиране на цветя и емаскулация

Цветята бяха покрити с крафт торба преди синтеза следобед от -1 DPA, за да се избегне излагането на светлина; и торбите бяха достатъчно големи, за да позволят отваряне на цветя. Цветята от едно и също растение и една и съща позиция бяха взети като контрол и бяха изследвани от 11 ч. Сутринта на 0 DPA до 6 сутринта на 1 DPA. За третиране на еваскулация на цветя, прашникът и плодникът на всяко цвете бяха внимателно отстранени с ножица приблизително в 8 часа сутринта при 0 DPA, когато венчелистчетата не бяха напълно отворени. Цветя от едни и същи растения и в същото положение бяха взети като контрол и анализирани в 8 сутринта на 1 DPA. За всяко третиране бяха анализирани повече от пет цветя.

Измерване на PH

РН на памучното цвете е измерено съгласно предходен доклад [4]. По три свежи цветя за всяка обработка бяха събрани от полето. Венчелистчетата се събират, промиват се два пъти с дейонизирана вода в рамките на 15 минути след отстраняването от растението и след това се смилат с пестик и хоросан за 1 минута в 5 ml дейонизирана вода на цвете. РН на хомогената се измерва незабавно с рН електрод (Mettler-Toledo FE20, Шанхай).

Количествена PCR в реално време

Памучните цветя се събират в различни моменти от време за анализ на експресията на флавоноиден ген. Екстракцията на РНК се извършва, следвайки процедурата на Spectrum Plant Total RNA Kit на Sigma-Aldrich (САЩ), синтезът на cDNA и qRT-PCR се извършват, както е описано по-рано [48], с ген на памучен убиквитин UBQ7 като референтен ген [49]. Флавоноидните генни последователности са получени от публичната банка данни на NCBI UniGene и от последователността на генома D на памука (http://www.phytozome.com/). Експресията на всички гени се нормализира до UBQ7. Бяха направени три биологични повторения. Лентите за грешки представляват стандартните отклонения (SD). Всички грундове са изброени в таблица S1. Комплектите за обратна транскрипция SuperScript® III са от Invitrogen (Карлсбад, САЩ). Реагентите (iTaq SYBR Green supermix с ROX) за PCR в реално време бяха от Bio-Rad (Foster City, USA).

Резултати

Цветът на памука (Gossyoium spp.) Съдържа разнообразни цветове

Анализирани са зародиши от китайската информационна система за ресурсите на зародишни зародиши (A) и Националната система за зародишни зародиши (B), със записани цветове на венчелистчетата. Цветовете са класифицирани според записа. Gossypium hirsutum (Gh), G. barbadense (Gb) и G. arboreum (Ga) са трите основни вида памук в тези системи. Останалите бяха класифицирани като „други“ и съдържаха предимно див памук.

Цветът на памучното цвете се променя драстично след цъфтежа

A, цветя от G. hirsutum YZ1, T586 и G. barbadense 3-79 бяха събрани от полето в 11 ч., 12 ч., 15 ч. И 18 ч. На 0 DPA (посочени като 0-11, 0-12, 0 -15 и 0-18, съответно) и 6 сутринта на 1 DPA (посочено като 1-6). В, съдържанието на антоцианин в тези цветя е измерено при A530. Бяха анализирани три повторения с повече от пет цветя за всяко повторение. Лентите за грешки представляват SD.

Сянката намалява натрупването на антоцианини в памучните цветя

A, Фенотиповете на YZ1 цветя с обработка на сянка бяха анализирани от 11:00 на 0 DPA (0-11) до 6 am на 1 DPA (1-6). В, съдържанието на антоцианин за съответните цветя от времевата точка беше измерено при A530. Лентите за грешки представляват SD с три повторения. За всяко повторение бяха анализирани повече от пет цветя.

Нивата на експресия на гените на антоцианиновия път са в съответствие с промяната на цвета

Фенотипното наблюдение на развитието на цветя от памук предполага, че биосинтезата на антоцианин се контролира както от фактори на околната среда, така и от генетични фактори (Фигура 3). Следователно, ние допълнително проучихме транскрипцията на гени, участващи в този път (Фигура 4). Транскрипциите на свързаните с флавоноидите и антоцианините биосинтезни гени PAL, CHS, F3H, DFR, FLS, ANR, ANS и UFGT са изобилни от цветя и драматично засегнати от светлината. Експресията на CHS, F3H, ANS и UFGT показва постепенно увеличаване на модела по време на развитието на цветя и по-ниски нива на засенчване на цветя в сравнение с това при нормална светлина (Фигура 4B, C, E и F). Тези открития корелират с натрупването на антоцианин (Фигура 2 и 3 Б). Освен това гените CHS и UFGT също показват съответстващ модел на експресия с натрупването на антоцианин в 3-79 и T586 цветя (Фигура S3A и B). Тези гени могат да играят важна роля в натрупването на антоцианин и промените в цвета на цветята.

Преписи на PAL (A), CHS (B), F3H (C), DFR (D), ANS (E), UFGT (F), ANR (G) и FLS1 (H) бяха анализирани чрез qPCR. Цветя от YZ1 с нормална светлина (L) или в сенчеста обработка (S) бяха събрани от полето в пет времеви точки (от 11 ч. На 0 DPA (0-11) до 6 ч. Сутринта на 1 DPA (1-6)). Преписи са нормализирани с израза на UBQ7. Бяха изпълнени три повторения. Лентите за грешки представляват SD.

Експресията на FLS1, която е свързана с биосинтеза на флавонол, достигна своя връх в 11 часа сутринта при 0 DPA (когато се натрупа малко червен цвят, Фигура 2А) и след това се понижи до много ниско ниво в 15 часа при 0 DPA (когато червеният цвят се появи, Фигура 2А) и остава основната линия за точките на почивка от развитието на цветето (Фигура 4 Н); този ген е експресиран по подобен начин в цветята на 3-79 и T586 (Фигура S3C). Експресията на FLS1 е силно зависима от светлината, но много малко транскрипти са открити в третирани със сянка цветя (Фигура 4 Н). Експресията на PAL, DFR и ANR достигна максимума в 18:00 на 0 DPA и след това рязко намаля (Фигура 4А, D и G). PAL и DFR показват светлинен индуциран модел на експресия, но ANR не е силно повлиян от светлината (Фигура 4 A, D и G). Подобни модели на експресия на ANR се наблюдават и при 3-79 и T586 цветя, въпреки че не е доминиращ при цветя T586 (Фигура S3D). Експресията на повечето гени във флавоноидния път е индуцирана от светлина, но подобен модел на експресия за тези гени, с изключение на FLS1, се наблюдава по време на развитието на цветя, независимо от излагането на светлина. Тези профили на експресия на гени са свързани с цветовите промени на цветето, което предполага, че генетичният контрол е доминиращ за метаболизма на антоцианина, докато биосинтезата на флавонол може да бъде под зависим от светлината контрол.

Флавоноидът е основният пигмент, отговорен за цвета на памучното цвете

A, венчелистчета от YZ1 и f3h бяха събрани от полето при 0 и 1 DPA. Екстрактът от метанол е показан от дясната страна. Наблюдава се значителна промяна на цвета. В, съдържанието на антоцианин се измерва при A530. Лентите за грешки представляват SD и бяха извършени три повторения. За всяко повторение бяха анализирани повече от пет цветя.

Генетичните и екологични взаимодействия контролират метаболизма на флавоноидите в памучното цвете

A, цветя от f3h линии бяха анализирани от 11 ч. На 0 DPA (0-11) до 6 ч. Сутринта на 1 DPA (1-6). Цветята, третирани с нормална светлина или сянка, са обозначени съответно с ‘-L’ и ‘-S’. В, съдържанието на антоцианин за съответните цветя беше измерено при A530. Лентите за грешки представляват SD и бяха извършени три повторения. За всяко повторение бяха анализирани повече от пет цветя.

Преписи на PAL (A), CHS (B), F3H (C), DFR (D), ANS (E), UFGT (F), ANR (G) и FLS1 (H) бяха анализирани чрез qPCR. Цветя от f3h с нормална светлина (L) или в сянка (S) бяха събрани от полето в пет времеви точки (от 11 часа сутринта на 0 DPA (0-11) до 6 часа сутринта на 1 DPA (1-6)). Преписи са нормализирани с експресията на UBQ7 и са извършени три повторения. Лентите за грешки представляват SD.

Дискусия

Памучните цветя се изучават повече от век. Въпреки че са наблюдавани много различни цветни цветове, е доказано, че пигментите на памучното цвете съдържат предимно флавоноли [35]. Жълтите цветя на Gossypium herbaceum и G. barbadense съдържат госипитрин, изокверцитрин кверцимеритрин и хербацитрин, а червените цветя на G. arboreum също съдържат изокерцитрин [35], [50]. През много години на въвеждане и отглеждане, основните култивирани и събрани памучни зародишни плазми се състоят от G. hirsutum, а основният цвят на памучното цвете е кремавата (Фигура 1). Въпреки това, пигментът, отговорен за кремавия цвят, също се състои от флавоноиди и вероятно също флавоноли, тъй като мълчанието на F3H в памука води до бели цветя (Фигура 5А). Екстрактът от червени памучни цветя показва висока стойност на OD при 530 nm, което показва високо съдържание на антоцианин (Фигури 2 и 5). Всички тези резултати потвърждават, че цветът на памучните цветя е свързан главно със съдържанието на флавоноиди.

подкрепяща информация

Фигура S1.

Ефект на оплождането върху натрупването на антоцианин в памучните цветя. A, нормално оплодени (Y-F) и емаскулирани YZ1 цветя (Y-U) бяха събрани от полето в 8 часа сутринта на 1 DPA. В, антоцианините на Y-F и Y-U цветята са измерени при A530. Бяха изпълнени три повторения. Лентите за грешки представляват SD.