•  

Jing Wang, Cheng Long, Haijun Zhang, Yanan Zhang, Hao Wang, Hongyuan Yue, Xiaocui Wang, Shugeng Wu, Guanghai Qi

монооксигеназа

Ключова лаборатория по биотехнологии на фуражите към Министерството на земеделието, Институт за изследвания на фуражите, Китайска академия на земеделските науки, Пекин 100081, Китай.

Цитат:
Wang J, Long C, Zhang H, Zhang Y, Wang H, Yue H, Wang X, Wu S, Qi G. Генетичен вариант в съдържащата флавин монооксигеназа 3 променя липидния метаболизъм в кокошките по специфичен начин на хранене. Int J Biol Sci 2016 г .; 12 (11): 1382-1393. doi: 10.7150/ijbs.16472. Достъпно от https://www.ijbs.com/v12p1382.htm

Ключови думи: съдържаща флавин монооксигеназа 3, триметиламин, липиден метаболизъм, кокошка носачка, генетичен вариант, хранителен прекурсор на ТМА

Кокошките носачки могат да осигурят обещаващ животински модел за изследване на метаболитния път на ТМА и неговия отговор на различни генетични и екологични фактори [19-21]. Само несинонимната мутация FMO3 c.984 A> T, което причинява заместване на треонин със серин при аминокиселина 329 (T329S) на пилешкото FMO3, е силно свързано със синдрома на миризма на риба [19]. Рапичното брашно (RM) е често срещана фуражна съставка за птиците, но богата на синапин, предшественик на ТМА. Натоварването с метаболизъм на ТМА и синдромът на миризма на риба при кокошките носачки често се предизвиква чрез хранене на RM [21]. Тук използвахме нецелево, базирано на ядрено-магнитен резонанс (ЯМР) метаболит, за да изследваме генетичните варианти, свързани с метаболизма при птици, хранени с две дефинирани диети, съдържащи различни количества предшественик на ТМА. След това извършихме анализ на РНК секвениране (RNA-Seq), за да идентифицираме гени или генни пътища, които са в основата на метаболитната промяна, индуцирана от генетичния фактор.

Генетичен вариант в FMO3 променя метаболизма на триметиламин при птици

Първоначално изследвахме ефекта на генетичния вариант T329S през FMO3 относно метаболизма на ТМА при птиците. Използвахме кокошки, генотипизирани като FMO3 c.984 A> T (TT), както и тези с хомозиготен нормален (AA) генотип. Като се има предвид, че както генетичните, така и диетичните фактори играят важна роля в метаболизма на ТМА, осигурихме на кокошките или основни диети от царевично-соево брашно (SM), които съдържат по-ниски нива на предшественик на ТМА (25% (P = 0,023), докато тенденцията за намалена активност на FMO (15%) при ТТ кокошки не е статистически значима (Фигура 1г).

Мутацията на T329S изглежда предизвиква инхибиране на синтеза на триглицериди и холестерол и по-голямо стимулиране на разграждането на липидите. Нивата на тРНК на гените, участващи в синтеза или регулирането на триглицеридите и холестерола, като протеин, свързващ елемент на регулацията на стерола 1 (SREBP1), ацетил-КоА карбоксилаза алфа (ACACA), ацетил-КоА карбоксилаза бета (ACACB) и 3-хидрокси-3-метилглутарил коензим А редуктаза (HMGCR), не се различават между кокошки АА и ТТ. Въпреки това, повишената експресия на индуциран от инсулин ген 2 (INSIG2) предполага намаляване на узряването на SREBP и стабилизиране на HMGCR [29,30]. Нивата на иРНК на TRC8 и MC5R бяха увеличени с T239S при SM диетични условия. TRC8 участва в ускореното със стероли убиквитиниране на HMGCR, а MC5R играе пряка роля в насърчаването на липолизата и потискането на повторната естерификация [31,32]. Успоредно с това, нивата на иРНК на гени, участващи в хидролизата на вътреклетъчния холестерилов естер (неутрален холестеролов естер хидролаза 1, NCEH1) и β-окисление на мастни киселини в пероксизома, като хидроксистероидна (17-бета) дехидрогеназа 4 (HSD17B4), ацил-КоА оксидаза 2 (ACOX2) и 2,4-диеноил КоА редуктаза 1 (DECR1), са били по-високи при кокошките ТТ.

T329S също подобрява елиминирането на холестерола и триглицеридите от черния дроб чрез отлагане при образуване на жълтък или жлъчна киселина. Нивата на иРНК на ApoVLDL-II, ABCG5 и ABCG8, показа значително по-висока експресия при ТТ кокошки, отколкото при АА кокошки, когато се хранят със SM диети. ApoVLDL-II, ABCG5 и ABCG8 участват в транспортирането на холестерола и триглицеридите от черния дроб до яйчниците и жлъчния канал. Но T329S намалява нивата на иРНК на фосфолипиден трансферен протеин (PLTP), които участват в трансфера на фосфолипиди и свободен холестерол между липопротеините и са тясно свързани с атеросклерозата [33]. В допълнение, ние също така наблюдаваме повишена биосинтеза на първична жлъчна киселина в черния дроб на ТТ кокошки, както се доказва от повишени нива на иРНК на жлъчна киселина-CoA: аминокиселина N-ацилтрансфераза (BAAT), алфа-метилацил-КоА рацемаза (AMACR), хидрокси-делта-5-стероидна дехидрогеназа, 3 бета- и стероидна делта-изомераза 7 (HSD3B7), протеинов носител на стерол 2 (SCP2) и семейство носители на разтворени вещества 51, алфа субединица (SLC51α).

FMO3 може да бъде нов медиатор на чернодробния липиден метаболизъм. Нокдаунът на FMO3 намалява нивата на чернодробни и плазмени липиди в нокаутиращи мишки за LDL рецептори [8], намалява VLDL- и LDL холестерола при мишки, нокаутиращи чернодробни инсулинови рецептори [42] и ограничава производството на чернодробни оксистероли и холестерилови естери в холестерола- хранени мишки [9]. Обратно, свръхекспресията на FMO3 при трансгенни мишки увеличава чернодробните и плазмените липиди [8,9]. Изглежда, че регулаторната роля на FMO3 в липидния метаболизъм зависи от диетите, особено по отношение на различните нива на наличност на прекурсори на ТМА. При птици, хранени с по-ниски нива на предшественик на ТМА, T329S причинява повишаване на нивата на плазмен ТМА, чернодробна FMO3 иРНК, чернодробен холестерол и нива на триглицериди. За разлика от това, при птици, хранени с по-високи нива на предшественик на ТМА и показващи повишено производство на ТМА в цекалите, мутацията на T329S причинява репресия в намаляването на LXR пътя, но не засяга плазменото съдържание на ТМА или нивата на тРНК на FMO3. Предполагаме, че нивата на ТМА могат да действат като проксимални сигнали в модулацията на експресията на FMO3.

Изследванията, описани тук, показаха генетичния вариант T329S в FMO3 променен метаболитен отговор на ТМА и липидите към две дефинирани диети с различно съдържание на предшественик на ТМА. Тези данни предполагат функциите на FMO3 в метаболизма на ТМА и липидната хомеостаза в зависимост от диетата и допълнително разкриват, че LXR пътят и метаболизмът на PUFA могат да участват в тази модулация. Освен това, нашите данни показват нарушение в метаболизма на ТМА, причинено от генетични и диетични фактори, променен липиден метаболизъм при птици. Това откритие от своя страна разкрива връзка между метаболизма на ксенобиотичния ТМА и липидната хомеостаза и допълнително подкрепя, че FMO3 може да представлява централен регулаторен възел за възможни кръстосани връзки между метаболизма на ксенобиотиците и метаболизма на липидите. По този начин тези диетични фактори и нови допълнителни метаболитни ефекти трябва да бъдат взети под внимание, когато фармакологичната интервенция се разглежда като средство за насочване на метаболизма на ТМА като цяло или FMO3 директно. Тези открития допринасят за по-широкото оценяване на регулаторната роля на FMO3 и могат също така да дадат улики за разбирането на сложното взаимодействие на диети, богати на прекурсори на ТМА с генетичен вариант в FMO3 при други домашни птици и при бозайници.

Декларация за етика

Методите на това проучване са проведени в съответствие с Насоките за експериментални животни, създадени от Министерството на науката и технологиите (Пекин, Китай), и критериите, посочени в Ръководството за грижа и употреба на лабораторни животни от изследователския институт за фуражи, китайски Академия за селскостопански науки (FRICAAS). Всички експериментални протоколи върху животни са одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните на FRICAAS.

Птици, диети и събиране на проби

Транскриптомно профилиране

Обща РНК се изолира от чернодробни проби от всяка от 24-те кокошки (шест проби на група) с Trizol (Invitrogen, Carlsbad, CA). Качеството и концентрацията на общата РНК са измерени чрез 1.0% агарозен гел електрофореза и спектрофотометричен анализ (NanoDrop 8000 спектрофотометър, NanoDrop Technologies, Wilmington, DE), съответно. Конструирането и секвенирането на РНК библиотека бяха извършени в Shanghai Personal Biotechnology Co., Ltd. (Шанхай, Китай). СДНК библиотеките са конструирани съгласно Ръководството за подготовка на проби TruSeq RNA (Illumina, Сан Диего, Калифорния). Поли (А) тРНК беше изолирана от пречистена обща РНК с помощта на биотин-олиго (dT) магнитни перли и беше фрагментирана до генерирани средни размери на вложки от

350 bp преди създаване на cDNA библиотеки. Контролът на качеството беше проведен с помощта на зелена флуоресцентна спектрофотометрия Pico и биоанализатор Agilent 2100 (Agilent Technologies, Пало Алто, Калифорния). Генериран е клъстер, разреден до 4-5 pM и секвениран с помощта на системата Illumina NextSeq 500 със сдвоени краища 2 × 150-bp четения.

Количествен анализ на PCR в реално време (qRT-PCR)

За да се потвърди възпроизводимостта и точността на данните за експресията на гена RNA-Seq, получени от библиотеките на пилешкия черен дроб, qRT-PCR беше извършена върху шестте избрани гена (Фигура S2). Нивата на изразяване на FMO3 се определят също чрез qRT-PCR. Използваните в това проучване PCR праймери са изброени в таблица S4. PCR в реално време се извършва с помощта на ABI Step-One Plus PCR система в реално време (ABI 2700, Applied Biosystems, Foster City, CA). Относителните нива на експресия на гени бяха нормализирани спрямо ендогенната РНК контролна глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа (GAPDH) с 2 -ΔΔ° СТ метод [47].

Статистически анализ

Съответни автори: Shugeng Wu (wushugengcn) или Guanghai Qi (qiguanghaicn), Институт за изследвания на фуражите, Китайска академия на земеделските науки, 12 Zhongguancun Nandajie, Haidian, Пекин 100081, Китай. Тел: 86-10-82107317, факс: 86-10-82106054.

Получено 2016-6-14
Приет 2016-9-4
Публикувано 25.10.2016