Гастроентерология

Тази статия е част от изследователската тема

Механизми на хроничните чернодробни заболявания: Идентифициране на нови терапевтични цели Вижте всички 20 статии

Редактиран от
Шанън Глейзър

Тексаски център за здравни науки A&M, Медицински колеж

Прегледан от
Юджи Найто

Медицински университет в Киото, Япония

Хосе А. Уранга

Университет Рей Рей Хуан Карлос, Испания

Принадлежностите на редактора и рецензенти са най-новите, предоставени в техните профили за проучване на Loop и може да не отразяват тяхното положение по време на прегледа.

хепатопротективните

  • Изтеглете статия
    • Изтеглете PDF
    • ReadCube
    • EPUB
    • XML (NLM)
    • Допълнителни
      Материал
  • Цитат за износ
    • EndNote
    • Референтен мениджър
    • Прост ТЕКСТ файл
    • BibTex
СПОДЕЛИ НА

Оригинални изследвания СТАТИЯ

  • 1 Катедра по педиатрия, Медицински факултет на Университета Емори, Атланта, Джорджия, САЩ
  • 2 Секция за молекулярен метаболизъм и хранене, Катедра по педиатрия, Университетски медицински център Гронинген, Университет в Гронинген, Гронинген, Холандия
  • 3 Отдел по патология, Национален изследователски център за примати Yerkes, Университет Емори, Атланта, Джорджия, САЩ

Безалкохолната мастна чернодробна болест (NAFLD) е основен нарастващ здравен проблем в световен мащаб. По-рано съобщавахме, че прекъсването на ентерохепаталната циркулация на жлъчните киселини с помощта на абсорбируем апикален инхибитор на транспортера на жлъчна киселина, зависим от натрий (ASBTi; SC-435), намалява развитието на NAFLD при мишки с високо съдържание на мазнини. Способността на лечението с ASBTi да повлияе прогресията на NAFLD до неалкохолен стеатохепатит (NASH) и фиброза при модел на мишка, предизвикан от диета, остава неизпитана. В настоящото проучване ние оценихме дали лечението с ASBTi е хепатопротективно в холинодефицитен, дефиниран от L-аминокиселина (CDAA) модел на индуцирана от NASH фиброза.

Методи: Мъжки мишки C57Bl/6 бяха хранени с: (A) диета, дефинирана с L-аминокиселина, достатъчна за холин (CSAA) (31 kcal% мазнини), (B) диета CSAA плюс ASBTi (SC-435; 60 ppm), (C ) CDAA диета или (D) CDAA диета плюс ASBTi. Проследява се телесното тегло и приема на храна. След 22 седмици на диета се измерва чернодробна хистология, нива на холестерол и триглицериди и генна експресия. Измерва се отделянето на фекална жлъчна киселина и мазнини и се определя абсорбцията на мазнини в червата, използвайки метода на захароза полибехенат.

Материали и методи

Животни

Мъжки мишки C57Bl/6J на възраст 10 седмици са получени от лаборатории Jackson. Животните бяха настанени групово с по 4 мишки във вентилирана клетка (Super Mouse 750 Microisolator System; Lab Products), съдържащи постелки (1/8 ”Bed-O-Cobbs; Andersons Lab Bedding Products) при същата температура (22 ° C) и светлина/тъмен цикъл (12 часа; 7:00 до 19:00) контролирана стая на животновъдното съоръжение, за да се намалят разликите в околната среда. Мишките бяха хранени ad libitum в продължение на 22 седмици или с диета, дефинирана от холин с достатъчна L-аминокиселина (CSAA, Каталог # 518754; Dyets Inc., Витлеем, Пенсилвания, САЩ) или дефинирана с холин дефицитна L-аминокиселина диета (CDAA, Каталожен № 518753; Dyets Inc., Витлеем, Пенсилвания, САЩ) със или без 0,006% (тегл.) От ASBTi (SC-435). Това количество ASBTi в диетата осигурява доза от

11 mg/kg/ден на SC-435 (10). Диетите CSAA и CDAA съдържат 31% калории като мазнини (под формата на царевично масло и частично хидрогенирано растително масло; състав на мастни киселини: 23,4% наситени, 52,1% мононенаситени, 24,5% полиненаситени) и без добавен холестерол. Консумацията на храна се измерва чрез претегляне на нова и останала храна два пъти седмично. Приемът на калории се изчислява чрез умножаване на теглото на консумираната храна по тяхната калорична плътност. През последната седмица на диета мишките бяха настанени индивидуално, за да измерват абсорбцията на мазнини и екскрецията на фекални жлъчни киселини и неутрален стерол.

Експерименти с животни

Измервания на мастни киселини

Претеглените проби от синтетичната диета и изпражненията се осапуняват с метанолен NaOH, екстрахират се с хексан и се превръщат в метилови естери. Пробите бяха анализирани с помощта на газова хроматография (GC) за количествено определяне на метиловите естери на мастната киселина и определяне на количеството бехенова киселина (C22: 0), наситена (14: 0, 16: 0, 18: 0), мононенаситена (C18: 1) и полиненаситени (18: 1, 18: 2, 18: 3ω3, 20: 5ω3, 22: 6ω3) мастни киселини, както е описано по-рано (21, 22). Всяка хроматограма беше изследвана, за да се провери идентификацията на съставните мастни киселини и за контрол на качеството.

Хистология

Черният дроб беше отстранен, претеглен и част беше фиксирана в 10% неутрален буфериран формалин, вграден в парафин, разделен на 5 μm и оцветен с хематоксилин и еозин. Червеното оцветяване на Sirius беше извършено с помощта на вградени парафинови чернодробни секции (метод, адаптиран от Picrosirius Red Stain Kit, Polysciences, Inc., Warrington, PA, USA). Хистологията на черния дроб е оценена по заслепен начин от ветеринарен патолог (S.G.) за стеатоза, лобуларно възпаление и хепатоцелуларен балон, за да се получи резултатът за активност на NAFLD (NAS), както е описано (23). Червено оцветените участъци на Sirius бяха сляпо оценени от S.G.за Ishak Stage, използвайки оценките, адаптирани от Ishak et al. (24).

Чернодробни и йеюнални липиди

Чернодробните липиди бяха извлечени съгласно протокол, основан на метода на Folch (25). Накратко, липидите бяха извлечени от

60 mg тъкан, използвайки 3 ml хлороформ: метанол (2: 1) и се инкубира при 55 ° C в продължение на най-малко 2 часа. Фазите се разделят чрез добавяне на 0,05% (v/v) сярна киселина във вода и центрофугиране при 1500 rpm в продължение на 15 минути. Част от долния слой се прехвърля, изсушава се под азот и се разтваря във 2% (v/v) Triton X-100 във вода. Чернодробните концентрации на общия холестерол (Pointe Scientific, C7510-01-906), свободния холестерол (Fujifilm Wako Diagnostics, Cat # 993-02501) и триглицеридите (Fujifilm Wako Diagnostics, Cat # 994-02891 и Cat # 990-02991) са впоследствие измерени чрез ензимни анализи.

Генната експресия

Общата РНК беше изолирана от проксималното дебело черво и черния дроб, използвайки комплект miRNeasy (Qiagen, Cat # 74106). Обратната транскриптазна полимеразна верижна реакция (RT-PCR) беше извършена с 1 μg РНК, използвайки комплект за обратна транскрипция на cDNA с голям капацитет (Applied Biosystems, Cat # 4368814). Количествената PCR в реално време се извършва с главен микс на Sybr Green (Applied Biosystems, Cat # 4309155), като се използва PCR система в реално време StepOne Plus (Applied Biosystems). Експресионните нива на mRNA бяха изчислени въз основа на ΔΔ-CT метода; стойностите са средства за трикратно определяне и експресията е нормализирана с помощта на циклофилин. Последователностите на използваните праймери са публикувани по-рано (26).

Фекални жлъчни киселини и неутрални стерили

Фекалните пелети бяха сортирани, изсушени на въздух, претеглени и механично хомогенизирани. Неутралните стерини и жлъчните киселини бяха извлечени от 50 mg изпражнения или диета, както е описано (27). Накратко, пробите се нагряват в продължение на 2 часа при 80 ° С със смес от 1 М натриев хидроксид и метанол (3: 1). След това неутралните стерини се екстрахират два пъти с 2 ml петролев етер и се дериватизират с НЕ-Бис (триметилсилил) трифлуороацетамид (BSTFA) -пиридин-триметилхлоросилан (TMCS) (5: 5: 0,1). Жлъчните киселини бяха извлечени количествено от изпражненията, изолирани на колони Sep-Pak C-18, метилирани с метанол/ацетил хлорид (20: 1) и дериватизирани с BSTFA-пиридин-TMCS (5: 5: 0.1) (27). И неутралните стероли, и жлъчните киселини бяха измерени чрез газова хроматография (GC) (28). Общото количество жлъчни киселини или неутрални стерини се изчислява като сбор от отделните видове.

Статистически анализи

Данните са представени като средни стойности ± стандартно отклонение (SD), освен ако не е посочено друго. Извършени бяха статистически анализи и бяха създадени графики с помощта на GraphPad Prism 8 (GraphPad Software, La Jolla, CA, USA). Разликите между групите бяха оценени чрез еднопосочна ANOVA с Tukey след хок тест с изключение на Ishak Stage, който беше тестван с помощта на тест Chi-Squared. Различните малки букви показват статистически значими разлики (P 0,05) и няма ефект от лечението с ASBTi върху триглицеридите на йеюналната тъкан (μg на g тъкан, средно ± SD, н = 9–12 на група; CSAA: 23,2 ± 10,5; CSAA плюс ASBTi: 22,8 ± 9,2; CDAA: 29,8 ± 9,2; CDAA плюс ASBTi: 33,01 ± 10,7). Общото съдържание на холестерол в йеюналната тъкан (μg на g тъкан, означава ± SD, н = 9–12 на група) също не е различно (P > 0,05) между различните групи (CSAA: 2,5 ± 0,2; CSAA плюс ASBTi: 2,31 ± 0,23; CDAA: 2,27 ± 0,28; CDAA плюс ASBTi: 2,22 ± 0,39).

Дискусия

В заключение, това проучване показа, че лечението с ASBTi не влияе върху абсорбцията на мазнини в червата и не е защитно срещу чернодробна фиброза в холинодефицитен миши модел на NASH. Независимо от това, тези открития допринасят за нашето разбиране за употребите и ограниченията на диетата с дефицит на холин при мишки и потенциалните механизми, чрез които прекъсването на ентерохепаталната циркулация на жлъчните киселини може да повлияе на развитието на NAFLD и NASH. Индиректно модулиращата абсорбция на мазнини в червата чрез лечение с ASBTi е интересна потенциална терапевтична цел. Бъдещите проучвания, използващи различни модели за NASH, са оправдани, за да се разбере по-нататък връзката между жлъчните киселини и прогресията на чернодробната стеатоза до NASH и фиброзата.

Декларация за наличност на данни

Наборите от данни, генерирани за това изследване, са достъпни при поискване от съответния автор.

Декларация за етика

Проучването върху животни е прегледано и одобрено от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в университета Emory.

Принос на автора

AR, IP и SG извършиха експериментите и събраха и анализираха данните. AR ръководи проучването. AR, SK и PD са проектирали изследването и са замислили експериментите. PD, IP, AR и SK написаха статията.