Кеничи МАСУДА

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Япония

Atsushi SATO

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Япония

Ацуши ТАНАКА

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Япония

Акико КУМАГАЙ

1) Animal Allergy Clinical Laboratories Inc., SIC-2 # 301, 5-4-30, Nishihashimoto, Midori-ku, Sagamihara-shi, Kanagawa 252-0131, Япония

Резюме

Елиминационните диети често съдържат протеини и пептиди с ниско молекулно тегло (MW), получени в резултат на ензимно смилане (хидролиза) на протеини от изходни материали [2, 10, 20]. Хидролизираните протеинови диети се считат за терапевтични за домашни животни, тъй като те могат да предотвратят алергични реакции поради свръхчувствителност към храна [2]. При хората IgE може да разпознава протеинови алергени с MW в диапазона от 5-50 kDa, следователно хидролизираните протеини в диетите за елиминиране трябва да имат MW по-ниска от 5 kDa, за да се предотвратят алергични реакции [29]. Неотдавнашно проучване при кучета показа, че кучешка диета, направена от хидролизирано брашно от птиче перо, съдържащо 95% хидролизирани протеини с MW ≤1 kDa, не предизвиква клинични реакции при нито едно куче, алергично към пиле. Обаче друга диета, съдържаща 78% хидролизирани протеини от пилешки черен дроб с MW ≤1 kDa, предизвиква алергични реакции при 40% от кучетата [2].

Клинично проучване на кучета, диагностицирани с хранителна свръхчувствителност след ограничаване на храна и провокация, установява, че реакции на свръхчувствителност от тип IV на лимфоцити са медиирани при 82% от кучетата, но свръхчувствителност от тип I рядко се открива [8]. Друг доклад, оценяващ клинични случаи на кучета с хроничен дерматит и съмнения за свръхчувствителност към храна, потвърждава тази тенденция [5]. В допълнение, проучване, проведено върху кучета със стомашно-чревни симптоми, клинично диагностицирани като възпалително заболяване на червата, установи, че периферните лимфоцити реагират на поне един хранителен антиген при всички животни [12]. Анализът на поточната цитометрия разкрива, че лимфоцитите от тип IV, свързани със свръхчувствителност, са CD4 + помощни Т-лимфоцити [5, 21]. Теоретично тези видове лимфоцити реагират на протеини или пептиди, които не предизвикват IgE-медиирани реакции [10, 14]. Следователно е ясно, че клиничната употреба на хидролизирани диети, като част от програмите за елиминиране на храна, може да не е подходяща за всички кучета със свръхчувствителност към храна.

SDS-PAGE

Хидролизираните диетични и екстракти от пилешко месо (Greer Laboratories, Inc., Lenoir, NC, USA) се разделят чрез SDS-PAGE в 5–20% градиент полиакриламиден гел (ATTO Corp., Токио, Япония), използвайки описания по-рано метод [ 11]. Общите количества протеин в D-1, D-2 и екстракт от пилешко месо бяха коригирани на 10 µg на лента. След електрофорезата гелът се оцветява с брилянтно синьо Coomassie (CBB) (FUJIFILM Wako Pure Chemical Corp., Осака, Япония) или реагент за сребърни петна (Cosmo Bio Co., Ltd., Токио, Япония) за визуализация на протеинови ленти.

Хроматография за изключване на размера

Хроматография за изключване на размера на екстрактите се извършва, като се използват леки модификации на предварително докладвана процедура [11]. Колона Superdex 200 10/300 GL (GE Healthcare Bio-Sciences AB, Упсала, Швеция) беше уравновесена с фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Всяка проба се елуира изократично при скорост на потока 0,5 ml/min в PBS и елуирането на протеини се наблюдава с UV абсорбция при 280 nm. Колоната е калибрирана с Gel Filtration Low MW Kit (GE Healthcare Bio-Sciences AB), съдържаща различни MW протеинови стандарти: феритин (MW 440 kDa), алдолаза (MW 158 kDa), коналбумин (MW 75 kDa), овалбумин (MW 43 kDa), карбоанхидраза (MW 29 kDa), рибонуклеаза A (MW 13,7 kDa) и апротинин (MW 6,5 kDa).

Стимулиране на лимфоцитите

Проточна цитометрия

Както беше описано по-рано [5, 14], антителата, използвани в анализа на поточната цитометрия, включват анти-кучешко CD4 антитяло на плъх, маркирано с Alexa Fluor 647 (Clone YKIX302.9) (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA), и античовешко CD25 антитяло, белязано с фикоеритрин (Clone ACT-1) (DAKO Cytomation, Glostrup, Дания), както и изотипни контроли като пречистен IgG2a, маркиран с Alexa Fluor 647 (Bio-Rad Laboratories), и PE- белязан миши IgG1 (Bio-Rad Laboratories). Оцветените мъртви клетки се изключват чрез включване на пропидиев йодид. И накрая, CD4 + CD25 + клетки бяха измерени в лимфоцитна порта с FACS Canto II и FACS Diva софтуер (Becton Dickinson, San Jose, CA, USA). Определихме броя на активираните помощни Т-лимфоцити срещу всеки антиген, като изчислихме процента на CD4 + CD25 ниски лимфоцити в 2500 CD4 + лимфоцити [18, 19]. Дефинирахме активирането като ≥0,4% CD4-положителни Т-лимфоцити, тъй като поне десет положителни клетки (0,4% от 2500 клетки) потвърдиха наличието на отделна клетъчна популация.

могат

SDS-PAGE от екстракти D-1 (път 1), D-2 (път 2) и пилешко месо (път 3) с брилянтно синьо Coomassie (CBB) и сребърно оцветяване. Общото количество протеин, приложено към всяка лента, е 10 ug. Имайте предвид, че няма визуализирани ленти в лента 1. SDS-PAGE, натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза.

Хроматографията за изключване на размера разкрива 6-8 пикови протеинови форми с различни молекулни тегла както в D-1, така и в D-2 (Фиг. 2 и and 3 Фиг. 3). Въз основа на стандартните протеинови реагенти, двата основни пика имат приблизително MW> 1 kDa, приблизително 1,5 kDa и 3,5 kDa. В екстрактите D-2 беше открит пик с MW> 440 kDa (най-големият стандартен протеин). И трите партиди продукти D-1 и две партиди продукти D-2 показват сходни вълнови модели (фиг. 3). Данните за хроматография за изключване на размера, получени в различна лаборатория (Toray Research Center, Inc., Токио, Япония), разкриха пикови форми на вълната, подобни на нашите резултати (данните не са показани).

Хроматография за изключване на размера на екстракти от D-1. Анализът се повтаря с три различни партиди продукти. Подобни вълнови модели бяха открити във всички партиди продукти.

Хроматография за изключване на размера на екстракти от D-2. Анализът се повтаря с две различни партиди продукти. Подобни вълнови модели бяха открити във всички партиди продукти.

Лимфоцитни отговори на хидролизирани протеини и свързани с птици антигени

От общо 316 PBMC проби, изследвани в проучването, положителни отговори на лимфоцитите (≥0,4%) срещу екстракти D-1 и D-2 са открити в 91 (91/316, 28,8%) и 75 (75/316, 23,7%) проби, съответно (Таблица 1).

маса 1.

Птици Общо≥0,4% а) б)
D-1 ≥0,4%7219.91
D-1 Таблица 1). Екстрактите D-1 и D-2 предизвикват положителни отговори в 130 проби, които не показват положителни отговори на лимфоцитите към антигени, свързани с птици; 20 проби (20/130, 15,4%) отговориха на D-1 и 19 проби (19/130, 14,6%) на D-2. Прилагането на теста Chi-squared демонстрира, че няма връзка между максималния процент положителни отговори на лимфоцитите към свързани с птици антигени и положителните отговори към екстракта D-1 или D-2.

Само седем (7/316, 2,2%) проби D-1 и шест проби D-2 (6/316, 1,9%) предизвикват лимфоцитни реакции със стойности ≥ 1,2%.

ДИСКУСИЯ

Хидролизираните диети се считат за ефективни при програми за елиминиране на домашни животни с хранителна свръхчувствителност, тъй като те съдържат протеини или пептиди с молекулно тегло, които обикновено са твърде ниски, за да стимулират алергични реакции. Съобщават се обаче клинични случаи на кучета с хранителна свръхчувствителност, които не реагират положително на програми за елиминиране на храна с хидролизирани диети [2]. В допълнение, предишен доклад разкрива, че няколко въглехидратни протеини с молекулно тегло, вариращи от 21–67 kDa, и тези, разпознати от серумния IgE от отделни случаи на кучета със съмнения за свръхчувствителност към храна, са били открити в същите търговски диети, разгледани в това проучване [22 ]. В това проучване, SDS-PAGE геловете от екстракти D-1 и D-2 разкриха ленти с малко по-висока MW от 24 kDa. В допълнение, пик с изключително висока MW (> 440 kDa) беше открит само в D-2 екстракти с хроматография за изключване на размера. Тези резултати предполагат, че тип I свръхчувствителност може да се появи в клинични случаи, когато серумният IgE реагира на протеините.

Въпреки че се подозира потенциална индукция на Т-лимфоцитни реакции срещу хидролизирани протеинови диети, индуцирането на клинични симптоми, свързани с хранителна свръхчувствителност при кучета, се счита за малко вероятно поради три причини. Първо, в това проучване, Т-лимфоцитни отговори със стойности ≥1,2% са открити само в седем от 316 (2,2%) и шест от 316 (1,9%) случая, стимулирани съответно от D-1 и D-2. Тъй като 1,2% се счита за праг за клинична проява на свръхчувствителност към кучешка храна [5], хидролизираните диети трябва да бъдат безопасни в повечето случаи. Второ, при кучета, хранени с хидролизирани диети, стомашно-чревното храносмилане трябва да намали молекулния размер на протеини или пептиди, като евентуално предотвратява антигенността срещу Т-лимфоцитите. Например, честото стомашно-чревно смилане на колаген in vitro води до малки пептиди с MW Bexley J., Kingswell N., Olivry T.2019. Кръстосана реактивност на серумен IgE между риба и пилешко месо при кучета. Ветеринар. Дерматол. 30: 25 – e8. doi: 10.1111/vde.12691 [PubMed] [CrossRef] [Google Scholar]