Обобщение

Миши модели на атеросклероза са полезни инструменти за изследване на патогенни пътища на молекулярно ниво, но изискват стандартизирана количествена оценка на развитието на лезиите. Този протокол описва оптимизиран метод за определяне размера на лезията в основните артериални съдове, включително аортния корен, аортната дъга и брахиоцефалната артерия.

Резюме

Сърдечно-съдовите заболявания са основната причина за смърт в света. Основната причина в повечето случаи е атеросклерозата, която отчасти е хронично възпалително заболяване. Експерименталните изследвания на атеросклерозата изясниха ролята на холестерола и възпалението в болестния процес. Това доведе до успешни клинични изпитвания с фармацевтични агенти, които намаляват клиничните прояви на атеросклероза. Внимателните и добре контролирани експерименти на миши модели на болестта могат допълнително да изяснят патогенезата на заболяването, което не е напълно изяснено. Стандартизираният анализ на лезиите е важен за намаляване на експерименталната вариабилност и увеличаване на възпроизводимостта. Определянето на размера на лезията в аортния корен, аортната дъга и брахиоцефалната артерия са често срещани крайни точки при експерименталната атеросклероза. Този протокол предоставя техническо описание за оценка на атеросклероза на всички тези места в една мишка. Протоколът е особено полезен, когато материалът е ограничен, както често се случва, когато се характеризират генетично модифицирани животни.

Въведение

Сърдечно-съдовите заболявания са основната причина за смърт в света, тъй като исхемичната болест на сърцето и инсултът представлява една на всеки четири смъртни случая 1. Повечето случаи са причинени от атеросклероза, заболяване, характеризиращо се с бавно натрупване на натоварени с липиди плаки с признаци на хронично възпаление в големи и средни артерии 2. Болестта обикновено остава незабелязана в продължение на няколко десетилетия, докато разкъсването или ерозията на плаката не предизвика артериална тромбоза, която води до исхемично увреждане на тъканите.

Нормалната артерия се състои от интимен слой с ендотелни клетки и слабо разпределени гладкомускулни клетки, медиен слой с гладкомускулни клетки и еластични ламели и заобикалящ адвентициален слой с хлабава съединителна тъкан 3. Интимно задържане на LDL компенсира развитието на атеросклероза 4. Натрупването и модификацията на липопротеини водят до агрегиране и захващане в артериалната интима 5. Възпалителен отговор се предизвиква от уловените и модифицирани липопротеини 6. Ендотелните клетки започват да експресират адхезионни молекули, като например VCAM-1 на места в артериалното дърво с бурен кръвен поток, което води до набиране на циркулиращи моноцити и други левкоцити 7. Инфилтриращите се моноцити се диференцират в макрофаги, които поглъщат липидите с последваща трансформация в макрофаги пяна клетки 8 .

Атеросклерозата е изследвана при модели на мишки с нарастваща честота от средата на 80-те години. C57BL/6 е най-често използваният инбреден миши щам за тези проучвания и се използва като генетичен фон за повечето генетично модифицирани щамове 9. Този щам е създаден през 20-те години на 10-ти и неговият геном е публикуван през 2002 г. 11. Експериментите с модели на мишки имат няколко предимства: колониите се размножават бързо, жилищата са ефективни в пространството и инбридингът намалява експерименталната вариабилност. Моделът също така позволява генетични манипулации, като целенасочени генни делеции и вмъкване на трансгени. Това доведе до ново патофизиологично разбиране на заболяването и нови терапевтични цели 12 .

Мишките от див тип C57BL/6 са естествено устойчиви на атеросклероза. Те имат по-голямата част от циркулиращия холестерол в HDL и сложни атеросклеротични лезии не се образуват дори когато се хранят с диета с високо съдържание на мазнини и висок холестерол 13. Следователно хиперхолестеролемични мишки, като Apoe -/- на C57BL/6-фон, се използват като експериментални модели на атеросклероза 14, 15. Липсата на ApoE нарушава чернодробното усвояване на остатъчни липопротеини и силно нарушава метаболизма на липидите. При Apoe -/- мишки циркулиращият холестерол е предимно във VLDL частици и мишките развиват сложни атеросклеротични плаки при обикновена чау диета.

Ldlr -/- мишки имитират развитието на атеросклероза, наблюдавана при хора с фамилна хиперхолестеролемия 16. Мишките Ldlr -/- се нуждаят от диета от западен тип, за да развият атеросклероза 17. Западната диета имитира приема на храна от хора и обикновено съдържа 0,15% холестерол. LDL рецепторът разпознава ApoB100 и ApoE и медиира поемането на LDL частици чрез ендоцитоза. LDL рецепторите са основни за чернодробното изчистване на LDL от циркулацията, докато експресията на LDL рецептор в хематопоетичните клетки не влияе на този процес. Това отваря възможността за трансплантация на костен мозък на Ldlr +/+ клетки в хиперхолестеролемични Ldlr -/- реципиенти и оценка на развитието на атеросклероза. Химерите на костния мозък често се използват за изследване на участието на хематопоетични клетки в експериментална атеросклероза. Трансплантацията на костен мозък обаче може да повлияе на размера и състава на атеросклеротичните плаки, правейки тълкуването на резултатите двусмислено.

Разработени са различни варианти на мишки Apoe -/- и Ldlr -/- с допълнителни генетични изменения за изследване на специфични процеси на заболяването 18. Един пример са човешки APOB100-трансгенни Ldlr -/- (HuBL) мишки, които носят пълния човешки APOB100 ген 19, 20. Тези мишки развиват хиперхолестеролемия и атеросклероза при редовна чау диета. Разработването на сложни атеросклеротични плаки обаче отнема най-малко шест месеца и по-кратки експериментални протоколи обикновено използват западна диета 21. Голяма част от плазмения холестерол циркулира в LDL частици, което придава на HuBL мишки по-подобен на човека дислипидемичен липопротеинов профил в сравнение с Apoe -/- и Ldlr -/- мишки. HuBL мишките също позволяват изследвания на човешки апоВ като автоантиген 22 .

Моделите на атеросклероза при мишки развиват сложни атеросклеротични плаки с общи черти на човешкото заболяване. Плаките обаче са доста устойчиви на руптура с последващ инфаркт на миокарда. Атеротромбозата е спорадично открита и експериментално предизвикателна за оценка на 23, 24, 25. Разработени са специални модели на разкъсване на плаката, но на експерименталното поле липсва надежден и възпроизводим модел за оценка на агентите, стабилизиращи плаката.

Количественото определяне на атеросклерозата се съобщава по много начини в литературата. Последните усилия се опитаха да стандартизират експерименталния дизайн, изпълнението и докладването на проучвания върху животни 26. Изследователите имат различни предпочитания и техники, адаптирани към техните лаборатории. Повечето изследователски проекти също са уникални по начин, който изисква някои модификации на протокола. Поради многофакторния характер на заболяването, оптималният контрол варира в различните проекти. Местните условия и липсата на стандартизация могат да причинят наблюдавани разлики в развитието на болестта, което възпрепятства напредъка в областта на изследванията. Различията в експерименталната вариабилност също означава, че статистическите изчисления на мощността трябва да се основават на пилотни проучвания при местни условия.

Количественото определяне на атеросклерозата се препоръчва на няколко места в съдовото дърво. Този протокол описва как да се получат резултати от аортния корен, аортната дъга и брахиоцефалната артерия в една мишка, в допълнение към оставянето на останалата част от торакоабдоминалната аорта за други анализи. Препаратите за лице позволяват бързо определяне на натоварените с липиди плаки в аортната дъга. Тежестта на заболяването в брахиоцефалната артерия също може да бъде количествено определена, ако пробите са внимателно показани. По-продължителното напречно сечение на аортния корен оставя няколко секции на разположение за подробна оценка на състава на плаката.

Протокол

Всички експерименти с животни изискват одобрение от етичните власти.

1. Миша жертва и микродисекция на аортата

определяне

Фигура 1: Сърце и аортна дъга in situ. (A) Белите дробове, трахеята, хранопровода и тимуса се отстраняват, за да се покаже аортната дъга in situ при 20-седмична женска мишка Apoe -/- на редовна чау-диета на микрофотография, скала = 2 mm. Пунктираните линии показват къде да се реже арката на аортата и нейните клони. (Б.) Схематично изображение на сърцето и аортата. Пунктираната линия в червено показва къде да се разреже сърцето, преди да се монтира аортния корен. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

2. Анализ на лицето на аортната дъга и брахиоцефалната артерия


Фигура 2: Количествено определяне на атеросклеротична лезия. (A) Аортна дъга от 20-седмична мъжка човешка APOB100-трансгенна Ldlr -/- (HuBL) мишка, хранена от Западна диета в продължение на десет седмици, отворена и оцветена за богати на липиди плаки със Судан IV. Общата площ на аортната дъга е очертана с пунктирана линия в бяло на микрофотографията, Скала = 2 mm. Пунктираните линии в жълто очертават общата повърхност на брахиоцефалната артерия. (Б.) Напречно сечение на аортния корен на 400 µm от аортния синус при 20-седмично мъжко Ldlr -/- захранено с мишка западно хранене за осем седмици, визуализирано на микрофотография, Scale Bar = 500 μm. Пунктираните линии в черно очертават общата площ на съдовете и атеросклеротичните лезии, оцветени с Маслено червено О, локализирани в артериалната интима. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

3. Криосекция на аортния корен


Фигура 3: Организиране на слайдове за серийни секции на аортния корен. По време на криосекцията на аортния корен трябва да се съберат всеки 10 µm дебел участък, обхващащ първите 800 µm от възходящата аорта. Необходима е систематична организация на слайдовете, за да се получат подходящи секции за различни приложения. Анализът на състава на лезиите обикновено включва оцветяване с Oil Red O за липиди и Picrosirius червено оцветяване за колаген. Останалите секции се събират и фиксират ацетон за имунохистохимия и оцветяване с имунофлуоресценция. Тази цифра е променена от Gisterå et al 30. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

4. Маслено червено оцветяване и количествено определяне на атеросклерозата в аортните корени

Представителни резултати

Oil Red O е мастноразтворима яркочервена диазо багрила, която оцветява неутрални липиди. Полярните липиди в клетъчните мембрани не са оцветени. Оцветяването с Oil Red O може да се извърши върху пресни, замразени или фиксирани с формалин проби, но не и върху проби, вградени в парафин, поради отстраняването на липидите в необходимия процес на депарафинизация. Количествено определяне на натрупването на липиди с увреждания може да се извърши чрез праг на цвета с положителна площ на маслото червено О положителна площ от общата площ на поражението (Фигура 4С). Хематоксилинът произвежда синьо оцветяване на клетъчните ядра, което е полезно за визуализиране на морфологията на плаката. Дясната и лявата коронарни артерии обикновено се отклоняват от аортата на около 250 µm от аортния синус 27, които често съвпадат с най-известните размери на лезиите. Напречните сечения от този регион често се показват като представителни резултати (Фигура 4D).

Oil Red O може да се използва за оцветяване на приготвени по лицето аорти, но този протокол използва Судан IV, друго удобно мастноразтворимо диазо багрило. Судан IV ясно визуализира атеросклеротичните плаки в оранжево-червен цвят чрез оцветяване на липиди, триглицериди и липопротеини. Премахването на тъмния фон в представителни изображения на аортните дъги на лицето може да подобри визуалния дисплей (Фигура 5А). Обикновено размерът на лезиите обикновено се разпределя в групите, което позволява статистическо тестване с t-тест на Student между групите. Точковият график, който показва както отделни мишки, така и средната стойност, която се сравнява между групите, е информативен начин за показване на резултатите (Фигура 5B-C). Тъй като вариацията в рамките на групи обикновено е различна между местата в съдовото дърво, обикновено са необходими отделни изчисления на мощността. Излишните вариации могат да бъдат избегнати чрез владеене на метода и стандартизация на протокола. Получаването на статистически значими резултати е важно, но винаги трябва да се има предвид и биологичното значение за наблюдавана разлика.


Фигура 5: Атеросклеротични лезии в аортната дъга и брахиоцефалната артерия. (A) Представител в лицето на микроснимки на аортни дъги с натоварени с липиди плаки, оцветени със Судан IV (в оранжев цвят) от 20-седмични мишки, хранени със западна диета в продължение на десет седмици, визуализирани заедно. Мащабна лента = 2 мм. Човешки APOB100-трансгенни Ldlr -/- (HuBL) мишки са използвани като контроли и експерименталната група се състои от TCR-трансгенни мишки с LDL-реактивни Т клетки (BT1), кръстосани с HuBL мишки. (Б.) Атеросклеротични лезии в аортната дъга (HuBL n = 10, BT1xHuBL n = 12; t-тест на Student). (° С) Атеросклеротични лезии в брахиоцефалната артерия (HuBL n = 8, BT1xHuBL n = 9, t-тест на Student). (Б.-° С) Точките представляват отделни мишки, стълбовете показват средна стойност ± SEM. * p ≤ 0,05. Тази цифра е модифицирана от Gisterå et al. 32. Моля, кликнете тук, за да видите по-голяма версия на тази фигура.

Допълнителна фигура 1: Алтернативна организация на слайдове за серийни секции на аортния корен. Опростена систематична организация на слайдове за събиране на секции от аортния корен. Колекцията позволява оцветяване с Oil Red O за липиди и имунохистохимично или имунофлуоресцентно оцветяване. Специални слайдове за Picrosirius червено оцветяване на колаген са пропуснати. Моля, кликнете тук, за да изтеглите този файл.

Дискусия

Важно е, че не само размерът на лезията трябва да бъде разгледан в проучванията на експериментална атеросклероза. Съставът на лезиите също е ключов параметър. Няколко характеристики на плаката са свързани с прояви на болестта при хората 36. Серийното секциониране на аортния корен оставя няколко секции на разположение за внимателен анализ на състава на плаката. Разкъсването на плаката при хората се характеризира с тънка влакнеста капачка с малко гладкомускулни клетки, оскъдно съдържание на колаген и признаци на възпаление в плаките 36. Въпреки че руптурата на плака е рядко събитие при миши модели на атеросклероза, маркерите за стабилност на плаката са информативни за оценка. Транслационните подходи могат да потвърдят механистичните констатации от модели на мишки и да разкрият важни характеристики на човешкото заболяване 31. Възпалителният статус на атеросклеротичните плаки може да бъде определен чрез имунохистохимично оцветяване на VCAM-1, MHC клас II, макрофаги и лимфоцити 30. Някои протоколи използват надлъжни разрези в короналната равнина на аортната дъга или брахиоцефалната артерия за измерване на размера и състава на атеросклеротичните лезии 37. Този алтернативен метод обаче оставя само няколко раздела за анализ, което ограничава неговите приложения.

Разкриване

Авторите нямат какво да разкриват.

Благодарности

Благодарим на всички предишни членове на експерименталното отделение за изследване на сърдечно-съдовата система на Göran K Hansson, които помогнаха за разработването на този протокол през последния четвърт век. Изключително сме благодарни за приноса на Антонино Николети, Синхуа Джоу, Анна-Карин Робъртсън и Ингер Бодин. Тази работа беше подкрепена от безвъзмездна финансова помощ 06816 и подкрепа на Линей 349-2007-8703 от Шведския изследователски съвет и от безвъзмездни средства от шведската фондация Heart-Lung, окръжен съвет на Стокхолм, фондация професор Nanna Svartz, фондация Loo и Hans Osterman за медицински изследвания, Изследователска фондация на Karolinska Institutet и Фондация за гериатрични заболявания към Karolinska Institutet.