• Принос от Nazzy Pakpour & Sharon Horgan
  • Асистент (Биологични науки) в Калифорнийския държавен университет

ДЕН 1:

Как да идентифицираме грам-положителните бактерии Staphylococcus и Streptococcus?

биология

В тази лаборатория ще проведем експерименти за идентифициране на следните видове:

  • Staphylococcus aureus: най-патогенният за хората; може да причини кожни инфекции и хранителни отравяния, но се среща и в микробиотата на назофаринкса
  • Staphylococcus epidermidis: част от нормалната флора на нашата кожа, но може да причини опортюнистични инфекции
  • Staphylococcus saprophyticus: причинява инфекции на пикочните пътища
  • Staphylococcus simulans: част от нормалната флора на нашата кожа, но може да причини опортюнистични инфекции
  • Streptococcus pyogenes: може да се намери в човешката кожа и може да причини различни инфекции (възпалено гърло, кожа)
  • Streptococcus pneumoniae: намира се в микробиота на назофаринкса, може да причини пневмония и менингит
  • Streptococcus agalactiae: намира се в микробиота на стомашно-чревния и пикочо-половия тракт, може да причини неонатални инфекции

MANNITOL SALT AGAR PLATE (MSA)

Селективен за грам-положителна бактерия (напр. Стафилококи). Ферментация на манитол от патогенни стафилококи, като S. aureus и S. simulans. се обозначава от агаровата среда, преминаваща от червено в жълто.

СЕЛЕКТИВЕН АГЕНТ: NaCl (сол)

ДИФЕРЕНЦИАЛЕН АГЕНТ: ферментация на манитолова захар

ИНДИКАТОР: Фенол червен

ИЗОЛИРАЙТЕ БАКТЕРИИ ОТ ВАШИЯ НОС:

В тази лаборатория ще бъдете помолени да изолирате различни видове бактерии от различни части на тялото си. Последващите биохимични тестове ще покажат променливостта, наблюдавана сред микробиотата на вашето тяло. В тази сесия ще изолирате стафилококови бактерии от носа и Streptococcus от гърлото.

1. Работейки с вашия лабораторен партньор, вземете две MSA плочи (табела 1 за проби от носа, плоча две за предоставени бактериални видове)

2. Използвайте стерилен памучен тампон, за да вземете проба ДЪЛБОКО в носа си.

3. Асептично нанесете пробата от носа си (НЕ SFIC, НЕ ТРАВЕН) върху половината от първата плоча на MSA. Инкубирайте при 37 ° C

4. Използвайки цикъл, асептично набраздете (НЕ SFIC, НЕ ТРАВЕН) предоставените три бактериални вида на MSA плоча №2. Инкубирайте при 37 ° C.

Ще сравнявате растежа между трите секции, така че се уверете, че вашите ивици са с еднакъв размер.

КРЪВНА АГАРНА ПЛАСТИНА

Богат на хранителни вещества; използва се за възстановяване на бактерии и гъбички от проби и може да определи хемолитични модели. Нашите чинии са направени с овча кръв.

СЕЛЕКТИВЕН АГЕНТ: няма

ДИФЕРЕНЦИАЛЕН АГЕНТ: хемолиза (способност за смилане/разграждане на еритроцитите)

α-хемолизата ще причини само частичен лизис на червените кръвни клетки и ще изглежда зеленикавокафява без ореол. Алфа хемолизата се причинява от водороден пероксид, произведен от бактериите, окислявайки хемоглобина до зелен метхемоглобин (напр. Streptococcus viridans и S. pneumoniae)

β-хемолитичната активност ще покаже лизис и пълно усвояване на съдържанието на червените кръвни клетки около колонията, повечето са патогенни (напр. Streptococcus pyogenes)

γ-хемолизата е нехемолитична (Streptococcus salivarius)

6. Съберете една BAP чиния.

7. Разделете BAP чинията наполовина. Използвайки стерилен тампон, вземете проба от гърлото на партньора си и асептично изпънете от едната страна на чинията.

8. След това вашият партньор ще вземе проба от гърлото ви и ще я нанесе асептично на другата страна на чинията. Инкубирайте при 37 ° C.

СЛЕДВАЩИЯ ПОРЦИОН, КОЙТО ЩЕ ПРАВИТЕ МАСА:

9. Разделете три плаки BAP наполовина и с помощта на стерилен тампон асептично направете тревна площ от бактериалните видове от всяка страна, както е показано на снимката по-долу.

10. Поставете подходящия антибиотичен диск върху всяка плоча. Инкубирайте при 37 ° C.

11. Използвайки цикъл, асептично изпънете (НЕ SFIC, НЕ ТРАВЕН) предоставените три бактериални вида върху плоча с кръвен агар. Инкубирайте при 37 ° C.

Използва се за разграничаване на CAMP-положителни Streptococcus agalactiae от CAMP-отрицателни Streptococcus pyogenes. Β-лизинът, произведен от β-хемолитик

Staphylococcus aureus действа синергично със Streptococcus agalactiae, за да създаде засилена хемолиза в региона между двете култури. The

синергична зона не се наблюдава при други стрептококи.

ТЕСТ НА ЛАГЕРА:

12. Уверете се, че сте маркирали всяка от вашите ивици върху Вашата BAP плоча за CAMP теста. Бактериите, които ще ви трябват за този анализ, са на стелаж в предната част на всяка маса. С бримка оформете златен стафилокок по права линия надолу по центъра на BAP плоча.

13. С примка, нанесете Streptococcus agalactiae като контрола перпендикулярно на ивицата S. aureus, но не докосвайте.

14. С бримка нанесете Streptococcus pyogenes от другата страна по подобен начин и инкубирайте при 37 ° C (без CO2).

ДЕН 2:

ТЕСТ ЗА ЗАЕК ПЛАЗМА

Използва се за разграничаване на патогенни и непатогенни членове на стафилококи. Екзо-ензимът коагулаза позволява превръщането на

фибриноген до фибрин за образуване на неразтворим съсирек. Staphylococcus aureus обикновено е коагулазно-положителен. Коагулазата е здраво свързана с повърхността на S.

aureus и може да покрие повърхността му с фибрин при контакт с кръв. Фибриновият съсирек предпазва бактерията от фагоцитоза и други защитни сили на

домакин. Инфекцията на кръвта със S. aureus, ако не се лекува, ще доведе до смърт.

1. Работейки с вашите лабораторни партньори, запишете резултатите си за вашите BAP, MSA и CAMP плочи на вашия работен лист.

2. Вземете ДВЕ епруветки с коагулаза.

3. Асептично инокулирайте епруветката с ИЛИ от следните:

  • много голяма лупа от носната ви проба (САМО ЖЪЛТИ КОЛОНИИ!)
  • Бактерии А от предоставената ви плоча

4. Асептично инокулирайте другата си епруветка с

  • Бактерии B от предоставената ви плоча

5. Внимателно разбъркайте и инкубирайте при 37 ° C.

HARDY StaphTEX СИН КОМПЛЕКТ:

5. Означете три от реакционните кръгове от HARDY StaphTEX Blue Kit като +, - и ?

6. Обърнете и смесете латексния реагент от HARDY StaphTEX Blue Kit.

7. Изстискайте 1 капка от повторно суспендирания латекс реагент върху 3 от реакционните кръгове на слайд-картата.

8. Добавете една капка положителна контрола върху друг кръг. Добавете една капка от отрицателната контрола върху друг кръг БЕЗ ДОКОСВАНЕТО НА КАПКИТЕ.

9. С помощта на дървена апликационна пръчка нанесете същите бактерии, които сте използвали в стъпка 3, в (?) Реакционния кръг и разбъркайте.

10. С помощта на отделна дървена пръчка смесете реагентите в (+) и (-) реакционния кръг НЕЖНО! Не забравяйте да разнесете сместа, за да покриете по-голямата част от кръга, тъй като ще улесни видимостта на реакцията.

11. Внимателно разклатете плъзгащата се карта за 20 секунди, за да разбъркате сместа (избягвайте разливането върху други реакционни кръгове). Запишете резултатите си на вашия работен лист.

Salmonella typhi причинява коремен тиф, докато Salmonella paratyphi причинява по-лека форма на заболяването. Френският бактериолог Джордж Уидал (1862-1929) разработва теста на Уидал, за да разграничи двете. Тестът Widal е серологичен тест, който използва суспензия на убита Salmonella typhi като антиген за откриване на наличието на антитела срещу Salmonella typhi в серума на пациента. Въпреки че използването на теста Widal в развитите страни отслабна, той все още използва диагностичен инструмент в развиващите се страни.

Титрите на антителата са ниски през първата седмица на заразяване с двете бактерии и бавно се повишават с течение на времето. Инфекциите с други грам-отрицателни бактерии могат да дадат фалшиво положителен резултат поради кръстосана реактивност. За да се гарантира достоверността на диагнозата, тестовете за пациенти се представят в сдвоени серумни проби (1-ви тест, направен рано и 2-ри тест, направен 2 седмици по-късно).

WID AL TEST:

12. Етикет 8 конусни тръби 1: 20,1: 40, 1:80, 1: 160, 1: 320, 1: 640, 1: 1280 и отрицателен контрол.

13. Добавете 500 μl стерилен физиологичен разтвор към всяка епруветка с помощта на пипета.

14. Вземете разреждане на серума от 1:10 (проба за пациент, която съдържа антитела) от вашия инструктор.

15. Добавете 500 μl пациентски серум към епруветката 1:20, вихър на пръстите.

16. Вземете 500 μl от епруветката 1:20 и пипетирайте в епруветката 1:40, вихър на пръстите.

17. Вземете 500 μl от епруветката 1:40 и пипетирайте в епруветката 1:80, вихър на пръстите.

18. Вземете 500 μl от епруветката 1:80 и пипетирайте в епруветката 1: 160, вихър на пръстите.

19. Вземете 500 μl от епруветката 1: 160 и пипетирайте в епруветката 1: 320, водовъртеж на пръста.

20. Вземете 500 μl от епруветката 1: 320 и пипетирайте в епруветката 1: 640, вихър на пръстите.

21. Вземете 500 μl от епруветката 1: 640 и пипетирайте в епруветката 1: 1280, вихър на пръстите.

22. Вземете 500 μl от епруветката 1: 1280 и изхвърлете.

23. Добавете 500 μl топлоубит HD S. typhi флагела антиген към всяка епруветка, ВКЛЮЧИТЕЛНО първоначалното разреждане 1:10 на серума на пациента и отрицателната контрола.