Резюме

Заден план

Сенилният пруритус е често срещан, но етиологията му остава неизвестна. Предполага се, че свързаните със стареенето дефекти на кожната бариера и промените на повърхностните липиди на кожата (SSL) играят важна роля в появата му. В настоящото проучване бяха изследвани липидомичните профили на SSL при пациенти в напреднала възраст, за да се разберат по-добре потенциалните причини за сенилен сърбеж.

Методи

Трансепидермалната загуба на вода (TEWL) се оценява, за да се оцени функцията на кожната бариера. Резултатът от Aleliorated Kawashima Itch Scale е използван за измерване на тежестта на сърбежа. Течна хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS) и анализ на многомерни данни бяха използвани за изследване на SSL промени.

Резултати

Резултатите показват, че пациентите със старчески сърбеж имат по-високи стойности на TEWL от контролните субекти (13,13 ± 4,28 срещу 6,71 ± 2,45), стр

Заден план

Сенилният сърбеж се определя като хроничен сърбеж при възрастни хора с неизвестна етиология и е диагноза на изключване, след като всички други причини за сърбеж са изключени [1]. С продължителната продължителност на живота в световен мащаб в условията на бърз медицински напредък, свързаните със стареенето кожни заболявания като старчески сърбеж стават все по-актуални [2]. Пруритусът е най-често съобщаваното дерматологично оплакване при възрастната популация [3]. Този силен сърбеж може да не се самоограничава и може да доведе до нарушения на съня и дори психиатрични усложнения като депресия в определени случаи, които значително намаляват качеството на живот [4]. Патофизиологията на старческия сърбеж остава неясна, въпреки че се предполагат няколко причини, включително свързани с възрастта промени в кожата, неврологични нарушения и анормални имунологични отговори [5]. Поради това спешно са необходими изследвания за сърбеж при възрастното население.

Липидите на повърхността на кожата (SSL) са смес от липиди на мастните жлези и междуклетъчни липиди, разположени във външния слой на епидермалните клетки. SSL играят важна роля в поддържането на функцията на кожната бариера и спомагат за регулирането на различни аспекти на покривната система, включително клетъчна пролиферация, клетъчна апоптоза, имунитет и възпаление [6]. Аномалиите в състава на SSL участват в патогенезата на често срещаните кожни заболявания като атопичен дерматит (AD), акне, псориазис и себореен дерматит [7]. Липидомиката е нововъзникваща област на изследване, която включва широкомащабна цялостна оценка на крайните продукти на липидния метаболизъм [8]. Течната хроматография, съчетана с тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS), е нова аналитична техника, използвана в липидомиката, която позволява идентифицирането и количественото определяне на клетъчните липидни видове [9].

Тъй като се знае малко за SSL профилите при старчески сърбеж, настоящото проучване използва LC-MS/MS за сравняване на SSL профилите при пациенти със старчески сърбеж с тези при контролни субекти без сърбеж, за да се изследва ролята на SSL в патогенезата на сенилния сърбеж.

Методи

Химикали и реактиви

Ацетонитрил (ACN), метанол, изопропанол (IPA) и Optima ™ LC/MS степен са получени от Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA, USA). Sebutape е закупен от CuDerm Corporation (Далас, Тексас, САЩ).

Участници

Измерване на TEWL

Измерванията на транссепидермална загуба на вода (TEWL) бяха извършени на място на 1 см под дясното коляно с помощта на преносим VapoMeter (TM300; CK, Кьолн, Германия). Времето за измерване беше 8–10 s. Накратко, VapoMeter се поддържа при стандартни условия на околната среда в хладно климатизирано помещение при температура 23 ° C и влажност 50%. След като сондата за откриване беше поставена върху целевата зона, бяха събрани три последователни показания от същия сайт и осреднени за всеки участник.

SSL вземане на проби

Преди събирането на пробите, участниците бяха инструктирани да останат при стандартни условия на околната среда (стайна температура 23 ° C и влажност 50%) в хладно климатизирано помещение за 30 минути. Себумът се събира от приблизително 4 cm 2 площ на същото място на 1 cm под дясното коляно с помощта на Sebutape. Преди събирането на себум, мястото за събиране се избърсва с 5% физиологичен тампон и един пластир Sebutape се поставя на целевото място. Пластирът Sebutape се оставя на място за 10 минути и след това се отстранява в стерилна епруветка за центрофугиране с помощта на извити форцепс. Всички проби веднага се съхраняват при - 80 ° C до по-нататъшен анализ.

Скала за интензивност на сърбеж за оценка на тежестта на сърбежа

Тежестта на сърбежа при всеки пациент е оценена чрез Aleliorated Kawashima Itch Scale (Допълнителна таблица 1) [10], която оценява тежестта на сърбежа по петстепенна скала (0, 1, 2, 3, 4) в отделни дневни и нощни оценки. Резултатът от сърбеж се изчислява чрез добавяне на дневния резултат към нощния резултат (диапазон, 0–8).

приготвяне на пробата

След извличане на пробите от фризера при - 80 ° С, към всяка епруветка се добавят 1,5 ml хлороформ/метанол (1: 2 v/v). Пробите с хлороформ и метанол се смесват чрез вихрови вибрации в продължение на 10 минути и се поставят при - 20 ° за 12 часа. След това се отстраняват 1,4 ml супернатант и се добавят 0,2 ml хлороформ за допълнително извличане на липидите. След това всяка епруветка се добавя с 1 ml дейонизирана вода и се центрофугира при 3000 хж за 5 минути, за да се разслои разтворът. След разслояването горният слой е водната фаза, а долният слой е органичната фаза. Нискотемпературен концентратор (Speed ​​Vac SPD131P; Thermo Fisher Scientific) беше използван за изсушаване на липидните екстракти за по-късен анализ. Преди откриването на масова спектрометрия, лиофилизираните проби се разтварят в 100 μL метанол/изопропанол (2: 1 v/v). Пробните смеси също бяха приготвени като проби за контрол на качеството за аналитични показатели преди анализ чрез течна хроматография с ултраефективна работа, съчетана с квадруполна тандемна масспектрометрия за време на полет (UPLC-QTOFMS).

LC-MS/MS анализ и идентификация

Течната хроматография се извършва с помощта на LC инструмент (Exion LC AD, AB SCIEX, САЩ: Exion LC AD, AB SCIEX, САЩ). LC разделянето се извършва, като се използва колона Phenomenex Kinetex 1.7u EVO C18 (2.1 × 50 mm, 100А; Agilent, Санта Клара, Калифорния, САЩ). Температурата на колоната е 40 ° С, а дозата на пробата е 3 μL. Скоростта на потока е 0,5 ml/min. Подвижната фаза А е 50% вода + 50% ACN + 10 mM амониев формиат, а подвижната фаза B е 10% ACN + 90% IPA + 10 mM амониев формиат. Условията на градиентно елуиране с подвижна фаза А и подвижна фаза В са показани в Таблица 1. MS се извършва с помощта на Triple TOF 5600+ (AB SCIEX, Concord, Онтарио, Канада) и ортогонален ускорен TOFMS, снабден с електроспрей йонен източник. Използван е режимът на йонизация на положителни и отрицателни йони от източник на йонизация с електроспрей. Методът за събиране на данни е TOF-MS-IDA-TOF-MS/MS (н = 8). Обхватът на сканиране на квадрупола беше m/z 50–1500. Подробните условия на източника на йони са показани в Таблица 2. Използвана е независима справка, Lock-mass ion чрез MS-Dial (версия 3.70; 17 април 2019 г.), за да се гарантира точност на масата по време на събирането на данни.

Присвоените модифицирани метаболитни йони бяха идентифицирани чрез търсене в базата данни в базата данни MS-Dial Lipidomics MSP (http: //prime.psc.riken.jb/compms/msdial/mail.html). Счита се, че хроматографското поведение на задържане намалява фалшиво положителните съвпадения [11].

Статистически анализ

Сравненията на двете групи, свързани с интензитета на интегрираните региони, бяха извършени с помощта на двустранен Welch’s т-тест, който беше извършен в рамките на MetaboAnalyst 4.0. Стойности на стр

Резултати

Клинични данни за пациенти и контроли

Клиничните данни за пациентите и контролните субекти, включени в проучването, са изброени в таблица 3. Всички участници са записани от януари 2019 г. до март 2019 г. 20-те пациенти със сенилен сърбеж обхващат 9 мъже и 11 жени и имат средна възраст от 69,05 ± 6,38 години. Всички пациенти са се оплаквали от сърбеж> 6 месеца. Дерматологичните прегледи показват кожна ксероза, декорутация или екскорация в долните крайници. 20-те контролни субекта обхващаха 8 мъже и 12 жени и бяха със средна възраст 67,4 ± 6,35 години. Двете групи не се различават значително по възраст (стр = 0,208) и пол (стр = 0,584).

Функция за бариера на кожата

TEWL обикновено се използва за оценка на човешката бариерна функция. Увеличението на TEWL обикновено представлява увреждане на кожната бариера [9]. В това проучване пациентите със старчески сърбеж имат значително по-високи стойности на TEWL от контролните субекти (13,13 ± 4,28 срещу 6,71 ± 2,45, р 2 = 0,9469, Q 2 = 0,12092; Фиг. 1). Тези резултати показват, че промените в SSLs могат да бъдат свързани с развитието на сенилен сърбеж.

липидомично

График на PLS-DA за оценка на липидите на повърхността на кожата (SSL) от пациенти със старчески сърбеж и здрави контроли. SSL профилите на старчески сърбеж (зелени точки) и контроли (червени точки) са очевидно разделени. R2 = 0.9469, Q2 = 0.12092

Разлики в SSL

Общо 796 SSL са открити от LC-MS/MS и са класифицирани в 25 категории. Впоследствие двете групи бяха сравнени за техните липидни видове. Въз основа на PLS-DA анализ и оценка на Q-стойност (фалшиво откритие), бяха използвани няколко параметъра за идентифициране на липидни видове със значителни разлики между пациентите със старчески сърбеж и контролните субекти. Тези параметри включват променлива важност за проекция> 1, промяна на сгъване> 1,2 или фиг. 2

Асоциации между SSL промени и увреждане на кожната бариера

За да се определи дали някои компоненти на SSL са свързани с нарушената функция на кожната бариера при пациенти със старчески сърбеж, бяха анализирани корелациите на TEWL с категории липиди. Сред всички сравнени липиди само няколко вида керамиди (Cer) имат положителни корелации с TEWL (Таблица 4). По-конкретно, нивата на Cer-EOS, Cer-NDS и Cer-NS имат значителни положителни корелации със стойността на TEWL.

Корелации на промени в SSL и тежест на сърбежа при старчески сърбеж

Силният сърбеж при старчески сърбеж може значително да повлияе на качеството на живот на пациентите. Поради това бяха оценени корелациите на тежестта на сърбежа с нивата на Cer. Бяха оценени корелациите на промените в SSL с оценката на тежестта на сърбежа, оценена от Ameliorated Kawashima Itch Scale. Сравнителните резултати са обобщени в Таблица 5. Като цяло, сфингомиелин, Cer-NP, Cer-AS, Cer-NDS и Cer-NS показват положителни корелации с пруритус, докато Cer-BS, Cer-EODS, Cer-EOS и Cer-AP има отрицателни корелации, въпреки че не се наблюдава статистическа значимост. Тъй като сфинголипидите са идентифицирани като важни сърбежни вещества [12], настоящите резултати предполагат, че значението на сфингомиелина при старческия сърбеж изисква по-нататъшно проучване.

Дискусия

Патофизиологията на старческия сърбеж остава неясна. Кожната ксероза е най-честата клинична характеристика при старческия сърбеж и се счита за последица от стареенето на кожата, свързано с намаляване на производството на пот и себум [3, 13]. Сухата кожа също се смята за важен фактор за задействане на сърбеж чрез промени в бариерната функция на роговия слой (SC) [14]. При хората SSL произхождат от себум, секретиран от мастни жлези и рогови кератиноцити, които покриват и защитават повърхността на кожата и играят роля за поддържане на влагата на кожата [15]. В резултат на това вариациите в състава на SSL могат да увредят функцията на кожната бариера. На свой ред увреждането на кожната бариера може допълнително да промени компонентите на SSL и да ускори кожната ксероза. Поради сложното взаимодействие между компонентите на кожната бариера, всякакви промени в състоянието на кожната повърхност, като SSL състав, могат да бъдат свързани с развитието на сърбеж. В настоящото проучване LC-MS/MS се използва за изясняване на липидните състави при пациенти със старчески сърбеж и асимптоматични контролни субекти.

Дисфункцията на епидермалната бариера е силно свързана с хроничен сърбеж [16]. Повишената TEWL води до активиране на серинови протеази като SC химотриптични ензими чрез увеличаване на рН на повърхността на кожата [17]. Повишената TEWL също е свързана с ксероза [18]. В настоящото проучване пациентите със старчески сърбеж са имали по-високи стойности на TEWL от контролните субекти и стойността на TEWL е положително корелирана с оценката за тежестта на сърбежа (данните не са показани). По този начин резултатите показват нарушена бариерна функция на кожата при пациенти със старчески сърбеж в сравнение с асимптоматични контролни субекти в напреднала възраст. Като се има предвид, че AD е възпалително кожно заболяване, характеризиращо се със силен сърбеж и увреждане на кожната бариера, това е добър пример за разбиране на физиологичната роля на епидермалната бариера. Когато епидермалната бариерна функция е повредена, външните стимуланти могат да навлязат в кожата, да причинят възпаление и да предизвикат медиатори, предизвикващи сърбеж [19]. Въпреки че не съществува значително възпаление при старческия сърбеж, разумно е да се предположи, че увреждането на кожната бариера при старческия сърбеж играе решаваща роля за предизвикване на подобен цикъл на сърбеж-надраскване, наблюдаван при AD.

По-рано са докладвани промени в SSL при няколко възпалителни заболявания, включително AD и акне [15, 20, 21]. При сравненията на липидните профили между пациенти със старчески сърбеж и здрави контроли, резултатите PLS-DA показват различни SSL състави в двете групи.

Cers са най-разпространените липидни съставки сред човешките SSL и съставляват приблизително 50% от междуклетъчното съдържание на липиди по маса. Промените в съдържанието на Cer на кожата са свързани с няколко заболявания, включително AD и псориазис [22]. Cer-EOS и Cer-NS са двата основни подкласа на Cers. Тези Cers са свързани с образуването на липидната обвивка на корнеоцитите в SC и играят решаваща роля за формирането на непокътната епидермална бариера на пропускливост [23]. В настоящото проучване връзките между Cers и кожната бариерна функция са определени чрез корелационния анализ на Pearson. Cer-EOS, Cer-NDS и Cer-NS показват значителни положителни корелации със стойността на TEWL. Тези открития могат да дадат представа за съответните роли на Cers за функцията на кожната бариера и да наложат допълнително разследване в проучвания върху сенилен сърбеж.

TAG е единственият основен липиден клас, който показва значително намаляване на сенилния сърбеж. TAG е второстепенен компонент на ламеларните тела и извънклетъчния матрикс на SC в здрава кожа [24, 25]. Намаляването на синтеза на TAG или повишеното разграждане на TAG може да доведе до тежки кожни дефекти при хора и мишки, а епидермалният метаболизъм на TAG играе ключова роля за поддържането на подходяща бариера на пропускливост в кожата [26, 27]. Предишни проучвания показват, че определени групи TAG са свързани с нарушена бариерна функция при AD [28]. По този начин, дефицитът на TAG може да бъде друг фактор, допринасящ за бариерната дисфункция при сенилен сърбеж.

Кожните липиди не само играят структурна роля за поддържане на кожната бариера, но също така имат разнообразни биологични и патофизиологични функции в кожата [29]. Сфинголипидите, като едно от важните сърбежни вещества, включват сложен набор от липиди, включително сфингомиелин и Cers. Активността на сфингомиелин деацилазата, ензим, който превръща сфингомиелин в сфингозилфосфорилхолин (SPC) и свободна мастна киселина, е повишена при пациенти с AD [30]. Интрадермално инжектиране на SPC предизвиква надраскване на задната лапа при мишки [31]. Въпреки че сърбежът в AD се организира от сложното взаимодействие на множество различни медиатори, SPC е един от факторите, допринасящи за това, че липидите могат да бъдат важно сърбежно вещество при хроничен сърбеж [16]. В настоящото проучване сфингомиелинът и някои Cers са в положителна корелация с резултата от сърбеж. Следователно по-нататъшните разследвания на пруритогенната функция на някои SSL могат да бъдат ценни.

Проучете силните страни и ограничения

Това проучване има няколко силни страни. Първо, това е първият анализ на SSLs при старчески сърбеж досега и позволява характеризиране на общите липидни профили, както и сравняване на подгрупи между пациенти и контролни субекти. Второ, чрез използването на нов подход за независимо събиране на данни в LC-MS/MS, чувствителността на анализа беше подобрена, което позволи цялостно безцелно събиране на молекулярни данни. Трето, анализът на коефициента на корелация на продукта и момента на Pearson беше използван, за да покаже връзките между SSL и тежестта на сърбежа, както и между профилите на Cer и стойността на TEWL, като по този начин предостави основа за идентифициране на механизма на липидното участие в кожната бариерна функция и сърбеж.

Като едно от ограниченията на проучването, малкият размер на пробата причинява статистически незначителни разлики в някои измерени липиди. Трябва да се вземат предвид и други фактори като диетичните предпочитания на пациентите, жизнените навици, сезоните и географските различия. Поради това се изискват проучвания върху пациенти в старческа възраст с пруритус, включващи по-големи проби и повече данни, за да се предоставят по-ясни доказателства за патологичните промени в липидния им състав. Независимо от това, това проучване ясно показва, че SSLs се променят при старчески сърбеж. Бъдещите проучвания на някои SSL компоненти към нови терапии за старчески сърбеж могат да донесат обещаващи резултати.

Заключения

В обобщение, проучването представи изчерпателна количествена характеристика на SSL и ясно разкри, че пациентите със старчески сърбеж имат различни SSL профили в SC, в сравнение с нормалните здрави контроли. Идентифицирани са разлики в експресията на 81 отделни липиди между пациентите със старчески сърбеж и контролните субекти. Корелационните анализи показват, че някои SSL компоненти са свързани с увреждане на кожната бариера. Въпреки че това проучване не може да докаже, че промените в SSL причиняват сърбеж на кожата, резултатите показват, че някои SSLs могат да бъдат причинителят или последицата от сърбеж при възрастни хора. Следователно по-нататъшните изследвания на пруритогенната функция на някои SSL могат да бъдат ценни. Необходими са по-нататъшни изследвания на старческия сърбеж, за да се помогне на възрастните хора да намерят подходящо лечение за старчески сърбеж. Бъдещите проучвания, фокусирани върху определени SSL компоненти, могат да доведат до нови терапии за старчески сърбеж.

Наличност на данни и материали

Всички данни, генерирани или анализирани по време на това проучване, са достъпни от съответния автор при разумно искане.