Резюме

Клиничен преглед. Пациентите дойдоха в лабораторията след пост през нощта. Височина, тегло, съотношение между талията и ханша и телесен състав с биоимпеданс с помощта на Bodystat Quad Scand 4000 (Bodystat Ltd.). Взета е проба от венозна кръв за определяне на липиди, глицерол, мастни киселини, албумин, С-реактивен протеин, инсулиноподобен растежен фактор I (IGF-I), лептин, норадреналин, адреналин и инсулин от акредитираната в болницата рутинна химия лаборатории, а предсърдният натриуретичен пептид беше измерен с помощта на RIA комплект (Phoenix Peptides). Хранителният статус беше оценен чрез използване на стандартизиран въпросник за онкологията, наречен Субективна глобална оценка (SGA; справка 12). Туморният стадий е класифициран следоперативно съгласно TNM Класификацията на злокачествените тумори от Международния съюз срещу рака, 6-то издание (13).

изследване

Биопсии на мазнини. След клиничния преглед, коремна с.к. биопсия на мазнини (0,5–1 g) се получава чрез иглена биопсия, както е описано (14). Парчетата тъкан (≈5 mg всяка) бяха бързо изплакнати с физиологичен разтвор и подложени на разследвания за липолиза. Една порция от 300 mg от събраната мастна тъкан се замразява в течен азот и се поддържа при -70 ° C за по-късни изследвания на генната експресия. Това беше направено за всички субекти, с изключение на три контроли за отслабване. Друга порция от 300 mg се запазва по същия начин за последващ Western blot анализ. Това беше направено за шестима пациенти с кахексия, осем стабилни контроли за тегло и две контроли за отслабване. По-рано показахме, че отстранените и замразени по този начин парчета тъкан не съдържат увредени клетки и кръв (15).

Липолиза. Останалата тъкан от иглената биопсия (500–600 mg) незабавно се обработва допълнително. Изолираните мастни клетки се получават чрез обработка на колагеназа на мастната тъкан; определя се размерът на мастните клетки; и експерименти с липолиза бяха направени върху изолирани мастни клетки, както е описано (16). Накратко, разредените суспензии на мастните клетки (2%, об./Об.) Се инкубират в албуминов буфер (рН 7,4), допълнен с глюкоза, аскорбинова киселина и, за експериментите с инсулин, аденозин дезаминаза и 10-3 mol/L от 8 -бромоцикличен AMP (8-Br-cAMP). Клетките се инкубират при 37 ° С в продължение на 2 часа без (базална) или с нарастващи концентрации (10-16 -10-5 mol/L, в зависимост от използвания хормон) на норадреналин, предсърден натриуретичен пептид, инсулин заедно с 10 -2 mol/L 8-Br-cAMP, 8-Br-cAMP (10 -2 mol/L) самостоятелно или 10 -2 mol/L 8-бромо-cGMP (8-Br-cGMP). След това се определя освобождаването на глицерол в инкубационната среда (индекс на липолиза). В допълнителни експерименти с липолиза, буферът, съдържащ 8-Br-cAMP плюс аденозин дезаминаза, също е допълнен с максимална ефективна концентрация (10-5 mol/L) на силно селективен инхибитор на хормоночувствителната липаза 4-изопропил-3-метил- 2- [1- (3- (S) -метил-пиперидин-1-ил) -метаноил] -2Н-изоксазол-5-он, наречен BAY (17).

За петима пациенти с ракова кахексия и осем стабилни контроли на тегло са получени достатъчни количества от стромовата фракция на мастната тъкан за изолиране на преадипоцитите. Тези клетки се диференцират точно както е описано (17) в продължение на 2 седмици и се правят експерименти с липолиза без (базална) или с 10-5 mol/L норадреналин, както е описано (16).

Данните за липолизата се изразяват по два начина: първият е освобождаването на глицерол на грам липиди в изследванията на зрели мастни клетки или на грам протеин в проучванията на преадипоцитите. Вторият е бил като функция на основното (нехормонално стимулирано) освобождаване на глицерол. Последното беше дефинирано като индуцирани от инсулина стойности, разделени на 8-Br-cAMP-индуцирани стойности в антилиполитичните експерименти и индуцирани от норадреналин или предсърден натриуретичен пептид стойности, разделени на базални стойности в липолитичните експерименти. Максималният ефект се дефинира като стойността, получена при максимално ефективна хормонална концентрация. Приоритет беше даден на експресията на липолиза като функция на базалната скорост, тъй като има силна връзка между този начин на изразяване на липолиза и експресията на HSL ген или протеин в човешки s.c. мастни клетки (18).

Експресия на протеини. Приблизително 300 mg бяла мастна тъкан се смачкват и лизират в буфер за лизис на протеини [1% Triton-X 100, Tris-HCl (pH 7,6) и 150 mmol/L NaCl, 4 ° C], допълнени с протеазни инхибитори [1 mmol/L фенилметилсулфонил флуорид и пълен (Boehringer Mannheim)] и се хомогенизира. Хомогенатът се центрофугира и инфранантът се събира и съхранява. Съдържанието на протеин се анализира с помощта на BCA Protein Assay Reagent Kit (Pierce). Сто микрограма общ клетъчен протеин се зареждат върху полиакриламидни гелове и се разделят със стандартен 12% SDS-PAGE. Геловете бяха прехвърлени в мембрани от поливинилидин флуорид (Amersham Pharmacia). Петната бяха блокирани за 1 h при стайна температура в буфериран с Tris физиологичен разтвор с 0,1% Tween 20 и 5% обезмаслено изсушено мляко. Това беше последвано от инкубация за една нощ при 4 ° С в присъствието на антитела, насочени срещу HSL (19) или контролния протеин β-актин (Sigma). Вторичните α-заешки антитела, конюгирани с хрянова пероксидаза, са от Sigma. Комплекси антиген-антитела бяха открити чрез хемилуминесценция с помощта на комплект за откриване (SuperSignal) от Pierce и определени ленти бяха открити и количествено определени с помощта на система Chemidoc XRS и софтуера Quantity One от Bio-Rad и изразени като съотношение HSL/β-актин.

Статистически анализ. Отчетените стойности са средно ± SD или медиана и диапазон. Стойностите с мастна тъкан се считат за нормално разпределени, тъй като ретроспективният анализ на предварително изследвани големи кохорти, използвайки същите методи за липолиза и експресия на ген или протеин, показва нормално разпределение на данните (18, 20, 21). Резултатите бяха сравнени с помощта на ANOVA и подходящи post hoc тестове, неспарен или сдвоен t тест на Student или линейна регресия по метода на най-малките квадрати. Тестовете на Kruskal-Wallis и Mann-Whitney са използвани за сравняване на стойностите на SGA и туморните резултати. Изчислението на мощността беше направено преди събирането на пациентите и се основаваше на известното по-рано разпределение на максималното освобождаване на глицерол, индуцирано от норадреналин, разделено на освобождаването на базален глицерол (22). Очаквахме набирането на пациенти с стабилно тегло да бъде по-лесно и очаквахме относителният дял между трите групи да бъде 2: 3: 2. Въз основа на тези оценки и средните стойности и SD на норадреналин/базална липолиза, изчислихме, че трябва да наемем 7 пациенти с кахексия, 11 пациенти с стабилно тегло и 7 пациенти с контрол на теглото, за да открием 70% разлика между кахексията и двете контролни групи в P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Характеристика на учебните групи

Липолиза in vitro. Инсулинът инхибира липолизата по подобен зависим от концентрацията начин в трите групи (фиг. 1). Максималното инхибиране на липолизата варира от 55% до 60% в тези групи (фиг. 1).