Отделение за системна екология, Стокхолмски университет, Стокхолм, Швеция

паша

Отделение за системна екология, Стокхолмски университет, Стокхолм, Швеция, Департамент по приложни екологични науки, Стокхолмски университет, Стокхолм, Швеция

Фигури

Резюме

Цитат: Motwani NH, Gorokhova E (2013) Мезозоопланктон Паша върху пикоцианобактерии в Балтийско море, както се предполага от анализа на молекулярната диета. PLoS ONE 8 (11): e79230. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0079230

Редактор: Ерик Сотка, колеж в Чарлстън, Съединени американски щати

Получено: 9 юли 2013 г .; Прието: 27 септември 2013 г .; Публикувано: 18 ноември 2013 г.

Финансиране: Финансовата подкрепа беше получена от Шведския изследователски съвет за околната среда, селскостопанските науки и териториалното планиране (FORMAS) и стратегическата програма за изследване на морската околна среда на Стокхолмския университет „Балтийско екосистемно адаптивно управление”. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Най-малките фотосинтетични организми включват автотрофния пикопланктон, разнообразна група, обединена с размер 13 С-белязан S. bacillaris като плячка.

Материали и методи

Декларация за етика

Вземането на проби се извършва в рамките на националния шведски мониторинг в крайбрежните води на Швеция и не са необходими конкретни разрешения за местата за вземане на проби от това проучване. Също така, ние не се нуждаем от етично одобрение за провеждане на това проучване, тъй като не сме обработвали или събирали животни, разглеждани в каквито и да било разпоредби за хуманно отношение към животните и в пробите или експериментите не са участвали застрашени или защитени видове.

Колекции от полеви зоопланктон

Синехококи във водния стълб

Фитопланктонът се събира с пластмасов маркуч (вътрешен диаметър 19 mm) като интегрирани проби от вода (0–14 m) по същите случаи като зоопланктона. Пробите бяха незабавно предварително филтрирани с 35 µm сито за отстраняване на голям планктон и 100–250 ml от филтрата бяха концентрирани върху 0.2 µm найлонова мембрана (диаметър 47 mm; Millipore ™). Филтрите се сгъват, прехвърлят се в епруветките от 1,5 ml Eppendorf и се съхраняват при -80 ° C до по-нататъшен анализ.

ДНК екстракция

Пробите от зоопланктон се инкубират в 40 µl 10% Instagene Chelex (Bio-Rad) за 30 минути при 105 ° C [33]. След центрофугиране (12 000 × g, 5 минути), супернатантата (30 μl) се прехвърля в чиста епруветка на Eppendorf и се съхранява при 4 ° C за 1-2 дни. За да се извлече ДНК от филтрите с фитопланктон, четири секции от всеки филтър бяха изрязани с щампован диаметър 7 mm и разрушени с помощта на инструмент Fast Prep® и стъклени перли (-1) и чистотата беше определена с Nanophotometer ™ (Implen); A260/A280 варираха от 1,8 до 1,9.

Количествено определяне на Synechococcus в зоопланктонните черва и водни проби

В тестовите проби Synechococcus spp. Броят на копията на ITS-1 се изчислява от стандартните криви. Молекулното тегло на стандарта беше използвано за изчисляване на броя на копията на ген на ITS-1 за реакция: където; NITS-1 е брой копия (μl -1), A е 6 × 10 23 е генните копия mol -1 (константата на Avogadro), DNA е концентрация на ДНК (g μl -1) и MW - молекулно тегло на ампликон, 46228 g mol −1 [39].

Общ фитопланктон

Вземането на проби и анализ на фитопланктона бяха проведени като част от Шведската национална програма за мониторинг, следвайки насоките на HELCOM [40]. Накратко, пробите се утаяват в камерата на Utermöhl и се изследват с помощта на инвертиран микроскоп NIKON с фазов контраст. Фитопланктонът (> 2 μm; ≥ 500 клетки) се преброява в диагонали или на половината/цялото дъно на камерата при увеличение 150 × и 400 ×;. клетъчният обем се изчислява от измервания на размера (≥25 клетъчни вида -1).

Непоглъщане на замърсяване с пикоцианобактерии (експерименти I и II)

За да се определи количеството Synechococcus, което може да е било прикрепено към външни части на тялото на копеподите, но да не бъде погълнато, бяха проведени експерименти за хранене с копепод Acartia tonsa, отглеждан в лабораторията и аксенови култури на Synechococcus bacillaris (CCAP 1479; размер на клетките: 2 µm ) и Rhodomonas salina (щам CCAP 978/24; размер на клетките: 8 µm) като храна; последното водорасло е висококачествена храна, често използвана в експерименти с Acartia [27]. Концентрациите на пикоцианобактериите и водораслите (клетки ml -1) се определят с помощта на хемоцитометър и се превръщат в въглеродна маса [41]. Тъй като се съобщава, че Synechococcus изгражда колонии и агрегати [42], културите са предварително филтрирани с помощта на сито 20 µm и е отбелязан броят на клетките, свързани в микроколонии (средно ± SD: 1,8 ± 0,3%; n = 5) при определяне клетъчни концентрации. За да се свърже номерът на клетките с номера на копие на ITS-1 в стандарта, ДНК се извлича от 200 µl култура S. bacillaris с известна клетъчна плътност, използвайки метод Chelex и се анализира чрез qPCR по същия начин като пробите на копеподите.

Поглъщане на въглерод от копеподи, хранени с пикоцианобактерии (експеримент III)

Статистически анализ

Съдържание на червата (GC) по отношение на Synechococcus ITS-1 копия ind. -1 и специфичен за размера GC (ssGC; копия µgWW -1, където WW е мокрото тегло на зоопланкторите [43]) в събраните на поле животни бяха сравнени между групи зоопланктон и видове чрез несдвоен t-тест с корекция на Welch за неравномерни дисперсии (GraphPad Prism 5.0®, софтуер GraphPad). Стойностите на δ 13 С на копеподите в експеримент III са сравнени между леченията (т.е. стартови животни, мъртви контроли и хранени копеподи), като се използва еднопосочен ANOVA, последван от последващи сравнения с теста на Tukey HSD. За да се оценят ефектите от Synechococcus и общото изобилие на фитопланктон върху GC в копеподите, генерализиран линеен модел (GLM) с нормално разпределение и log-link (Statistica v. 10, StatSoft Inc.) и обединени данни за Acartia spp. и E. affinis бяха използвани. Регресионният анализ беше ограничен до копеподите, тъй като данните за GC за тази група бяха налични в повечето случаи на вземане на проби. Данните бяха трансформирани от Box-Cox и остатъците бяха линейни, хомогенни, нормално разпределени и не корелирани.

Резултати

Наличие и изобилие на Synechococcus DNA в мезозоопланктона

Всички проби от зоопланктон, събрани на поле, са тествани положително за ДНК на Synechococcus (Таблица 1), докато не се наблюдава усилване в референтните проби (новоизлюпена Artemia). Количеството копия на ITS-1 варира около 7 пъти (8 × 10 3 до 53,8 × 10 3 на зоопланктор), със съществени разлики между видовете и групите (Таблица 1, Фигура 1). Разликите в GC между основните зоопланктонни групи са значителни: копеподи срещу микрозоопланктон (несдвоен t-тест; t17 = 2.150, p Фигура 1. Поява на Synechococcus spp. В събрания на поле зоопланктон.

Отделно чревно съдържание (GC; плячка ITS-1 копия × 10 3 ind -1) и специфично за размера съдържание на червата (ssGC; плячка ITS-1 копия × 10 3 µgWW -1) в основните зоопланктонни групи: копеподи (възрастни и по-възрастни копеподити от Acartia spp. и Eurytemora affinis), кладоцерани (Bosmina maritima и Podon spp.) и микрозоопланктон (ротифери Synchaeta spp., Keratella quadrata и K. cochlearis и copepod nauplii). Данните са показани като средна стойност ± SD, броят на пробите е даден под името на групата.

Промени в общия фитопланктон и пикоцианобактерии през сезона

През юли - септември 2008 г. околната среда Synechococcus spp. изобилието по отношение на броя на ITS-1 копия варира от 2.2 × 10 5 –7.6 × 10 5 копия ml −1, като най-високите стойности се наблюдават през август (средно месечно 4.9 × 10 5 копия ml −1). Общият обем на фитопланктона варира от 0,4 до 1,5 mm 3 ml -1, като пикът се наблюдава в края на август (1,5 mm 3 ml -1).

Връзка между приема на пикоцианобактерии и тяхното изобилие

Няма значителни разлики в GC между копеподитите на E. affinis и Acartia spp. при всеки повод за вземане на проби (t4 = 1,70, p> 0,05). Следователно, тези видове са обединени за GLM, свързващ отделен GC с изобилието на Synechococcus (ITS-1 копия ml -1) и общия фитопланктон (биообем, mm 3 ml -1). В този модел количеството ДНК на Synechococcus в червата на копеподите е положително свързано с изобилието на пикоцианобактерии и отрицателно с общите запаси на фитопланктона по време на вземането на проби (Таблица 2).

Експерименти I и II

ДНК на Synechococcus са открити както в убити, така и в живи копеподи, изложени на експериментална хранителна среда (Фигура 2), като стойностите са ∼5 пъти по-високи в живите копеподи (възрастни: t4 = 32,61, p 7 клетки ml -1). По този начин неприемният фон съответства на около 2200 и 965 Synechococcus клетки ind -1 за възрастни и наупли от Acartia tonsa, съответно.

Данните са показани като средно ± SD, n = 3 във всички случаи.

Експеримент III

Налице е значително поглъщане на въглерод от A. tonsa copepodites, хранени със Synechococcus (ANOVA; F = 556, p Фигура 3. Поглъщане на въглерод от 13-маркирани Synechococcus bacillaris от копеподите Acartia tonsa (живи и мъртви индивиди), изложени на пикоцианобактерията (експеримент) III).

Поглъщането на въглерод се изразява като промяна в δ 13 C на копеподите от началните стойности. Разликите между началото и всяка обработена група са показани със звездички (*: p 4 Synechococcus ITS-1 копира ind −1 (Таблица 1). Според теорията на филтрацията едноклетъчните организми −1 [42] и/или се срещат в хлабави агломерати, особено през лятото [50]. Наличието на тези колонии и агломерати в популациите на пикоцианобактериите би повишило значително ефективността на задържане на Synechococcus. Второ, автотрофният пикопланктон се среща в агрегати с отпадъчни частици и хетеротрофни бактерии, което повишава тяхната наличност за мезозоопланктон [ Накрая, копеподите, захранващи се с малки частици [51], могат да регулират стойката на своите филтриращи придатъци и да победят максилите си по-бързо от същите животни, хранещи се с големи частици, за да получат същата дажба [47].

В нашите експерименти за хранене, възрастен A. tonsa, изложен на Synechococcus bacillaris с много малко (3 и 21 × 10 3 Synechococcus ITS-1 копира ind-1 в лабораторно хранени и полеви събирани копеподи, съответно). По-голямото изобилие от клетки на пикоцианобактерии в червата на полеви копеподи може да бъде свързано с (1) по-голям размер на тялото на A. tonsa в сравнение с другите два вида Acartia [43] и по-нисък капацитет за поглъщане на пикопланктон, (2) по-голям брой пикоцианобактерии образуване на инертни материали в полето, увеличаване на степента на задържане и (3) вторично потребление в полето, където е вероятно да се появи хранене с протозоопланктон, хранене с пикопланктон Последният механизъм изисква допълнителни експериментални проучвания, за да се установи ефективност на откриване на ДНК в червата на мезозоопланктона за Synechococcus, претърпели вторично потребление. Тези експериментални данни и разликата показват, че както единичните, така и групираните пикопланктонни клетки могат да бъдат погълнати от копеподите и че всички механизми, описани по-горе, могат да допринесат за наблюдаваните вариации в консумацията на Synechococcus в полевия зоопланктон.

подкрепяща информация

Таблица S1.

Коефициент на регресия (r 2 ), ефективност на усилване (Е.), у-прихващат стойности на стандартните криви и не се генерират шаблони за контрол (NTC) при пет аналитични случая, като се използва синтетичният олигонуклеотид като стандарт за ITS-1 на Синехококи spp.