Игор Халин

1 Факултет по медицина и отбранително здраве, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Нито Laili Azua Jamari

2 Катедра по химия, Център за изследвания на фондацията за отбрана, Национален университет по отбрана в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Nadiawati Bt Абдул Разак

1 Факултет по медицина и отбранително здраве, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Zubaidah Bt Hasain

1 Факултет по медицина и отбранително здраве, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Мохд Асри бин Мохд Нор

3 Катедра по строително инженерство, Технически факултет, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Мохд Хакими бин Ахмад Зайнудин

4 Център за изследвания и управление на иновациите, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Ainsah Bt Омар

1 Факултет по медицина и отбранително здраве, Национален отбранителен университет в Малайзия, Kem Sungai Besi, Куала Лумпур, Малайзия

Ренад Аляутдин

5 Научен център за експертиза на медицински приложения, бул. Петровски, Москва, Русия

Принос на автора: IK, RA и AO замислят и проектират това проучване, извършват експерименти и пишат статията. NLAJ, MAMN и ZH оказаха помощ при сглобяването и прилагането на апарати и участваха в писането на хартия. NAR и MHAZ проведоха експерименти и също така участваха в писането на хартия. Всички автори одобриха окончателната версия на тази статия.

Резюме

Травматично увреждане на мозъка (TBI) е водеща причина за смърт и увреждане при хора в световен мащаб. Изработването на клинично значим TBI модел при дребни животни остава доста предизвикателство. За добър скрининг на потенциални терапевтични средства, които са ефективни при лечението на TBI, животинските модели на TBI трябва да бъдат създадени и стандартизирани. В това проучване установихме миши модели на затворена травма на главата, използвайки метода на Shohami за намаляване на теглото с някои модификации, свързани с оценката на когнитивния дефицит, и предоставихме подробно описание на тежкия модел на животни с TBI. Установихме, че 250 g падащо тегло от височина 2 cm е довело до тежка затворена травма на главата при мъжки мишки C57BL/6. Когнитивните разстройства при мишки с тежко затворено нараняване на главата могат да бъдат открити чрез тест за пасивно избягване на ден 7 след нараняване. Констатациите от това проучване показват, че животинските модели с нараняване при падане на тегло са подходящи за по-нататъшен скрининг на мозъчни невропротектори и потенциално са подобни на тези, наблюдавани при човешки TBI.

Въведение

В Малайзия травматичната мозъчна травма (TBI) е една от основните причини за смърт (Moppett, 2007). Въпреки че глобалният размер на TBI е неизвестен поради липсата на стандартизирано събиране на данни за TBI (Peeters et al., 2015), наличните данни предполагат, че броят на жертвите на TBI в световен мащаб рязко нараства (Alves, 2014). Например в Европа честотата на TBI се увеличава през последното десетилетие от 235 на 326 на 100 000 население годишно (Peeters et al., 2015). Освен това, според Световната здравна организация, TBI трябва да бъде основната причина за смърт през 2020 г. (Организация, 2006). Въпреки прогнозата за жертвите на ЧМТ се е подобрила през последните години, много оцелели от ТБИ страдат от емоционални, когнитивни и двигателни нарушения и намалено качество на живот.

Материали и методи

Животни

В това проучване бяха включени 62 мъжки мишки C57BL/6N (In Vivos®, Сингапур), на възраст 11–13 седмици, с тегло 25–28 g. Тези животни са държани в индивидуално проветрявани клетки (Techniplast®, Италия; n = 3/клетка) при 20–23 ° C при 12-часов цикъл светлина/тъмнина със свободен достъп до вода и храна (Teklad Global Diets®, САЩ) . Всички процедури, извършени върху лабораторни животни, са проведени в съответствие с насоките на комитета за грижа и употреба на животните на Националния отбранителен университет в Малайзия.

Апарати за производство на TBI

Устройство за TBI е проектирано и сглобено в Инженерния факултет на Националния университет по отбрана в Малайзия в съответствие с наскоро установения протокол (Flierl et al., 2009). Апаратът се състои от три успоредни хоризонтални равнини, съединени от четири успоредни вертикални метални пръта ( Фигура 1А ). Горната и средната повърхности са направени от акрилно стъкло и служат за задържане на метален прът с кръгъл пластмасов връх ( Фигура 1В ), който прониква през тях, като оказва удара върху черепа на животното. Долната платформа е направена от желязо, а главата на мишката може да бъде фиксирана върху нея, за да достави падащо тегло в определена област на черепа ( Фигура 1С ). Устройството трябва да се постави върху каменна повърхност, за да се намали разпространението на енергия.

модел

Апаратът, причиняващ черепно-мозъчна травма (TBI) при дребни гризачи.

(A) Устройството за TBI, което извършва метод за намаляване на теглото, за да се получи затворена травма на главата при мишки; (B) пластмасов кръгъл връх с диаметър 3 mm; (C) позиция на мишки на платформата; (Г) местоположение на зоната на въздействие; (E) педалът може да се натисне с ръка или крак, освобождавайки пръчката и причинявайки удара върху открития череп на мишката; (F) настройката, т.е. определеното тегло на определена височина може да се регулира с помощта на линийка и електромагнитна ключалка.

TBI процедура

След обща анестезия с интраперитонеална инжекция от 60 mg/kg натриев пентобарбитал (Dorminal, Alfasan, Holland), беше направен разрез по средната линия на черепа, кожата се прибра и черепът беше изложен за локализиране на зоната на удара ( Фигура 1D ). Мишките бяха разделени на случаен принцип на групи, задействани с фалшиви, 200 g тегло, 250 g тегло и 300 g капки.

Главата беше фиксирана ръчно на долната платформа на устройството за отпускане на тегло. Пластмасовият връх с диаметър 3 mm на метален прът с тегло 200 g, 250 g или 300 g внимателно се придвижва към открития череп на мишката в лявото полукълбо на 2 mm странично от средната линия и 2 mm назад от короналния шев. Главата се държеше на място ръчно, докато пръчката беше повдигната на височина 2 см и държана от магнит ( Фигура 1F ). Травмата е извършена чрез натискане на педала ( Фигура 1Е ), които изключиха магнита и пръчката свободно върху черепа на мишката. Веднага се доставя кислород (4 литра O2 на минута) с помощта на цилиндър под налягане за мишки в продължение на 2 минути, за да се избегне респираторна депресия. След интраперитонеално инжектиране на 0,05 mg/kg фентанил (Talgesil, Duopharma (M), Малайзия) мишките бяха върнати в клетките си. Фиктивните контроли получават само упойка и разрез на кожата.

Неврологична оценка на тежестта (NSS)

За да се стандартизира оценката на дефицита на неврологична двигателна функция при мишки след TBI, е създаден NSS (Chen et al., 1996). Тази скала имитира скалата на резултатите от Глазгоу, която е стандартен метод, клинично използван за оценка на функционалните неврологични и когнитивни резултати на пациенти с TBI (King et al., 2005). Първоначално NSS включваше 25 задачи за изпълнение, но след това броят на задачите беше намален до 10 (Chen et al., 1996; Flierl et al., 2009). Часовете за оценка на NSS обикновено са избрани като 1 час, 4 часа, 24 часа, 2 дни, 3 дни и 7 дни след нараняване (Flierl et al., 2009), но има много модификации на това (Sinson et al., 1997; Wu et al., 2014). NSS силно корелира с данните, получени с помощта на ядрено-магнитен резонанс и хистологично изследване (Tsenter et al., 2008) и по този начин отразява нараняване на мозъчната тъкан. Всяка задача на NSS е описана по-долу.

Задача 1: Излезте от кръга. В центъра на кръга беше поставена мишка ( Фигура 2Б ) и се следи времето, необходимо на мишката да излезе от апарата. Здравата мишка, тъй като има присъщо търсене, обикновено напуска кръга в рамките на 3 минути. Ако мишката все още беше вътре в кръга след 3 минути, беше дадена 1 точка, в противен случай бяха отчетени 0 точки.

Илюстрация на инструментите, използвани за оценка на оценката на неврологичната тежест (NSS) и пример за оценка на задачата.

(А) „Разходка с лъч“. За да изпълни задачата, мишката трябва да пресече лъча (3, 2, 1 см) в противоположната страна; (Б) „Изходен кръг“. Здравата мишка трябва да намери изхода извън кръга в рамките на 3 минути. (C) Пример за тест „Beam walk“; (D) „Баланс с кръгла пръчка“. Задачата се счита за успешна, ако мишката е в състояние да балансира с четирите лапи за 10 секунди.

Задача 2: Търсене на поведение. Отново, мишката беше поставена в центъра на кръга ( Фигура 2Б ), но изходът трябва да бъде затворен. Проследяваха се възможността на мишката да изследва околната среда и поведение на подушване в рамките на 3 минути. Когато мишката не изпълни търсещо поведение, се отчита 1 точка и ако се наблюдава търсещо поведение, се отчитат 0 точки.

Задача 3: Монопареза/хемипареза. За тази задача е използван анатомичен форцепс. Задържайки мишки до опашката, ние докоснахме лапите на мишката за форцепс. Ако мишката хване форцепса, са отчетени 0 точки и ако мишката не успее да хване или захваща с много ниска интензивност, се добавя 1 точка.

Задача 4: Права разходка. На празна повърхност беше поставена мишка, за да се оцени способността на мишката да ходи направо, както и нейната бдителност. Ако мишката демонстрира нарушен модел на походка и не успее активно да изследва околностите, ние преброихме 1 точка. Когато мишката показва нормално ходене, се дават 0 точки.

Задача 5: Стреснат рефлекс. Ако мишката покаже реакция на силната лапа, пляскане, се добавят 0 точки, в противен случай се дава 1 точка.

Задача 6: Баланс на лъча. Ако една мишка е успяла да балансира върху лъча (0,5 × 0,5 mm 2) в продължение на 10 секунди, се отчитат 0 точки, а ако мишката се провали, се дава 1 точка.

Задачи 7, 8, 9: Разходка с лъч. В края на 3-, 2-, 1-сантиметрова греда с дължина 30 см беше поставена мишка (Фигура Фигура 2A, 2A, C C ). Здравата мишка може лесно да пресече всички лъчи поради присъщия рефлекс за търсене. Ако мишка не пресече лъча или пристигне на противоположната страна в рамките на 3 минути, се дава 1 точка, в случай на успешно пристигане, се отчита точка 0. Ако мишката не успее да пресече лъч с широчина 3 см (или 2 см), допълнителни задачи с лъч с ширина 2 см (или 1 см) няма да бъдат изпълнени и са дадени съответно 3 или 2 точки.

Задача 10: Баланс с кръгла пръчка. Ако една мишка не успее да балансира за 10 секунди на кръглата пръчка с диаметър 5 мм, се добавя 1 точка и ако мишката успее да балансира, ние отчитаме 0 точки ( Фигура 2D ).

Всички точки от 10 задачи трябва да се сумират, за да се получат общи точки от NSS.

Тест за пасивно избягване

Тестът за пасивно избягване.

(A) Врата, подобна на гилотина, към видимо по-сигурна тъмна камера. (Б) Правоъгълната камера е разделена на две отделения: осветени от светлинен стимулатор отгоре и тъмни. (C) Настройки на удара (0,3 mA, продължителност 2 секунди) и оценка на времето (време за изключване 180 секунди).

Статистически анализ

Статистическият анализ беше извършен с помощта на GraphPadPrizm ® (La Jolla, CA, USA). Използван е двупосочен дисперсионен анализ, последван от Bonferroni post-hoc тестове. Всички резултати са изразени като средната стойност ± SD. Ниво на P Фигура 4 ). В групата с 200 g падащо тегло наблюдаваме подобна тенденция: първоначалният NSS е 3.83 ± 0.68, което показва лека мозъчна травма, без никакво подобрение в 4 часа след нараняване (3.67 ± 0.47). След това се наблюдава постепенно спонтанно възстановяване, тъй като NSS спада до 0.83 ± 0.68 точки на ден 7 след нараняване.

Резултати за неврологична тежест (NSS) при мишки с травматично мозъчно увреждане, причинено от падане на тегло от 250 g и 200 g.

Долната NSS представлява по-добра неврологична функция. Стойностите се изразяват като средната стойност ± SD (n = 6). Статистическият анализ беше извършен с помощта на двустранен дисперсионен анализ с Bonferroni post-hoc тест. * P Фигура 5 . Експлоатираните животни демонстрираха добра способност да научат задачата, тъй като избягваха да влизат в камерата, в която бяха шокирани предишния ден. Средната латентност беше равна; времето за прекъсване беше 180 секунди, както беше посочено в методите. Интересното е, че същите резултати бяха постигнати при мишки с TBI от двете експериментални групи на 1-ви и 4-ия ден. Въпреки това, на 7-ия ден средната латентност беше значително по-кратка при мишки с TBI, причинена от 250 g падащо тегло, отколкото при фалшиви мишки и мишки с TBI, причинени от 200 g падащо тегло. Това показва, че на 1 седмица след нараняване, мишки с TBI, причинени от 250 g падащо тегло, развиват когнитивен дефицит.

Когнитивна функция на мишки с черепно-мозъчна травма (TBI), използваща теста за пасивно избягване.