Отметка/Търсене в тази публикация

Тип методи:

Входна версия:

Цитат:

AttachmentSize
Моделиране на алкохолен панкреатит чрез захранване с етанол и предизвикателство за липополизахарид (LPS) 537,77 KB

Въведение

моделиране

Панкреатитът е известно усложнение на хронична злоупотреба с алкохол както с остри (некроинфламация), така и с хронични (фиброза и ацинарна атрофия) прояви. Последователността некроза-фиброза, при която алкохолният хроничен панкреатит еволюира от повтарящи се епизоди на остро нараняване, което в крайна сметка води до необратими увреждания и загуба на функция, сега е широко приета. Тази концепция се подкрепя от клиничното наблюдение, че пациентите с чести пристъпи на алкохолен панкреатит преминават по-бързо в хронично заболяване. Въпреки това, въпреки че се признава, че рискът от алкохолен панкреатит се увеличава с увеличаване на консумацията на алкохол, по-малко от 5% от тежките пиячи развиват клинично явен панкреатит, което предполага, че е необходим допълнителен задействащ фактор за иницииране на явно нараняване на панкреаса (1, 11). Липополизахаридът (LPS или ендотоксин, получен от клетъчната стена на грам-отрицателни бактерии) е потенциален, клинично значим фактор за задействане, тъй като повишени концентрации на ендотоксин в кръвта (получени от грам-отрицателни бактерии в червата) се откриват при алкохолици, дори след едно преяждане ( 5). Освен това е доказано, че нивата на ендотоксин в кръвта корелират с тежестта на панкреатита (2).

Трябва да се отбележи, че продължителното прилагане на алкохол ad libitum при плъхове не причинява никакви увреждания на панкреаса, като по този начин съвпада с човешката ситуация (8). Следователно, допълнителни стимули (като приложение на церулеин, церулеин и циклоспорин, тринитробензен сулфонова киселина (TNBS) и др.) Са приложени за предизвикване на остри и хронични лезии в панкреаса. Въпреки че тези модели са допринесли за разбирането на алкохолния панкреатит, нито един от тези фактори няма доказано физиологично значение.

Въз основа на ранен модел на алкохолен хепатит от Bhagwandeen и Apte et al (3) и по-скоро разработен модел на алкохолен остър панкреатит (6), ние установихме модел на алкохолен панкреатит на плъхове, базиран на приложение на етанол (течни диети на Lieber-DeCarli ) и многократни интравенозни инжекции на LPS от E.Coli. Този модел рекапитулира основните характеристики на хроничния панкреатит при човека, т.е. ацинарна атрофия и фиброза (9). По-важното е, че панкреатичните лезии регресират напълно в рамките на една седмица след спиране на алкохола (10).

Тази глава ще представи методологията за приготвяне на алкохолни диети, групово хранене и приложение на LPS при плъхове.

1.0 Материал

  1. Течни диетични епруветки за хранене (100 ml), Bio-Serv, Frenchtown, NJ 08825
  2. Поставки за течни диетични диети, Bio-Serv, Frenchtown, NJ 08825
  3. Клетки с телено дъно (по поръчка)
  4. Ограничител за гризачи в стил Брум, n ° 554-BSRR (плъхове), Plas-Labs, Lansing, Мичиган 48906
  5. Ограничител за гризачи в стил Брум, n ° 551-BSRR (мишки), Plas-Labs, Lansing, Мичиган 48906

1.1 Реактиви

1. Приготвяне на течни диети на Либер-ДеКарли

Работата на Чарлз Либер значително оформи нашето разбиране за алкохолната чернодробна болест. Едно от основните постижения на Либер беше да докаже, че консумацията на алкохол сама по себе си (а не диетични дефицити) води до увреждане на черния дроб. През 1963 г. Чарлз Либер и Леоноре ДеКарли установяват хранене с етанол като част от течна диета (7). При тази диета етанолът, когато присъства, е заместен с въглехидрати и съставлява 36% от общите калории. Алкохолната диета и контролната диета съдържат едно и също количество калории на обем диета. Това улеснява прилагането на изокалорични количества (= сходни количества калории, т.е. сходни обеми) от диетата за изследване на животни и съответните им контроли (хранене по двойки или групово хранене в зависимост от броя на контролите).

Таблица 1. Съдържание на хранителни вещества в течните диети на Lieber-DeCarli

Освен ако не е посочено друго, всички химикали са с аналитичен реагент и се предлагат от Sigma Chemical Company (Сейнт Луис, Мисури, САЩ).

а) Витаминна смес

б) Солен разтвор

Забележка: Разтворите за запаси се приготвят седмица преди започване на диетата и са стабилен при стайна температура за периода на хранене.

Забележка: . Сместа се разбърква при стайна температура, докато не се види утайка. Това отнема приблизително 1 час. Маслената смес е стабилен за 3 дни при 4 ° C на тъмно

г) Контролирайте течната диета

Различните компоненти на диетата се добавят в блендер съгласно таблицата по-горе. Както карагенанът, така и ксантамовата дъвка се поръсват равномерно върху съставките, за да се избегне образуването на бучки в диетата. След това диетата се смесва в блендера (3 - 4 импулса по 10 секунди всеки). Впоследствие диетата се допълва до крайния обем с двойно дейонизирана H2O. Контролната диета се съхранява максимум 3 дни при 4 ° C.

д) Алкохолна течна диета

Различните компоненти на диетата се добавят в блендер съгласно таблицата по-горе. Алкохолът се добавя последен. След това диетата се смесва с пасатор, както е описано по-горе. Диетата се допълва до желания обем с ddH2O. Алкохолната диета се съхранява максимум 3 дни при 4 ° C.

2. Приготвяне на LPS разтвор

  1. LPS от E.Coli B26: 026 (1 mg/флакон), лиофилизиран прах, n ° L2654, Sigma Chemical Company (Сейнт Луис, Мисури, САЩ.
  2. NaCl 0,9% (стерилен), Becton Dickinson (BD)

LPS от щама E.Coli B26: 026 се разрежда в NaCl 0,9% до крайна концентрация 5 mg/ml (200 ml NaCl 0,9% на флакон) непосредствено преди употреба. Към момента на инжектиране разтворът трябва да е със стайна температура.

2.0. Методи

1. Администриране на течни диети Lieber-DeCarli

Мъжки, мъжки, отбиващи плъхове Sprague-Dawley (110-130 g) се настаняват индивидуално в клетки с телено дъно (Фигура 5) и се хранят с изокалорични количества (т.е. идентични обеми) от течни диети на Lieber-DeCarli. Тъй като двете променливи в този модел са алкохол и LPS, по принцип се изискват следните групи:

i) Контролирайте диети, хранени с плъхове (C);

ii) Плъхове, хранени с алкохол (A);

iii) Плъхове, хранени с контролна диета, получаващи LPS инжекции (CL);

iv) Хранени с алкохол плъхове, получаващи LPS инжекции (AL).

Диетите се коригират в рамките на квартет от животни, включващ по един представител от всяка група. Препоръчва се да се включат животни със съпоставимо тегло (+/- 5%) в даден квартет, тъй като техните калорични изисквания вероятно ще бъдат подобни.

Диетичният прием на всяко животно в квартета е съобразен, така че всички плъхове в квартета да получават изокалорични количества от диетата. Ограничаващото скоростта животно (плъх, чийто дневен прием определя дневния прием на останалите 3 животни) обикновено е плъх, хранен с алкохол. Количеството диета, което трябва да се прилага, се изчислява и коригира ежедневно. Препоръчително е животните да се хранят по едно и също време на деня (обикновено сутрин).

Алкохолната диета се въвежда постепенно, като се използва следната схема:

Преследва се храненето 10 седмици преди инжектирането на LPS. Индивидуалната консумация на диета се записва в дневник.

2. LPS инжекции на опашната вена

Тази процедура се извършва в специална тиха зона извън помещението за хранене на животни (Фигура 1). Препоръчително е да се вземе едно животно в клетката. Клетката трябва да бъде увита в кърпа. Плъховете се извличат от клетките, задържат се в ограничител на животни и се претеглят. Опашката на плъх се загрява с помощта на инфрачервена светлина или топла вода. Мястото на инжектиране се избира възможно най-дистално и се дезинфекцира с етанол. Обемът на LPS разтвор за инжектиране се изчислява в зависимост от телесното тегло (3 mg/kg). Тази процедура се повтаря два пъти на седмични интервали (общо 3 инжекции). Приемането на алкохол/контролна диета продължава през целия период на инжектиране.


Фигура 1: Подготовка за инжекции на вената на опашката. Препоръчва се да се подготви конусовидна тъкан с малък (5 мм широк) отвор на върха. Плъхът търси подслон в тъканта (A). Животното се вкарва в ограничителя (B). Опашката на плъх се загрява на водна баня (С). Инжектиране на LPS/физиологичен разтвор в дисталната част на вената (D).

3. Жертва на опитни животни и обработка на органи

Животните се умъртвяват 24 часа след последното инжектиране на LPS/физиологичен разтвор чрез обезглавяване. Панкреатите се извличат и нарязват на 3 части (проксимален, среден и дистален панкреас). Това е, за да се избегне грешка при вземане на проби, тъй като лезиите могат да бъдат неравномерни. Пробите от всеки регион са разделени на парчета и могат да бъдат обработени, както следва: i) бързо замразяване в течен азот, ii) вграждане в OCT съединителна среда (за замразени секции) и iii) фиксиране в 10% неутрален буфериран формалин.

Острите лезии (некроза на ацинарни клетки, вакуолизация, възпалителен инфилтрат, кръвоизлив) се оценяват най-добре при оцветени с хематоксилин и еозин участъци.


Фигура 2: Ефект на етанол ± еднократна инжекция LPS върху панкреаса на плъх. Представителни H&E оцветени панкреатични участъци от плъхове, хранени с контролна диета, получаващи единична LPS инжекция (CLs) и плъхове, хранени с алкохолна диета, получаващи единична LPS инжекция (ALs). Плъховете на ALs показват значителна ацинарна вакуолизация (блокова стрелка), некроза на ацинарни клетки (стрелка), възпалителен инфилтрат (стрелка) и кръвоизлив (звезда). Установени са незначителни лезии в групата на CL. Оригинално увеличение x600.

Фиброзата се оценява на участъци на Masson’s Trichrome (Фигура 3) или Sirius Red. Степента на отлагане на колаген може да бъде допълнително оценена чрез анализ на хидроксипролин.


Фигура 3: Ефект на етанол ± многократни инжекции LPS върху отлагането на извънклетъчен матрикс в панкреаса на плъх. Представителният оцветени от трихром панкреатични секции на Masson от плъхове, хранени с контролна диета, получаващи многократни инжекции LPS (CLr), и плъхове, хранени с алкохолна диета, получаващи повторни инжекции LPS (ALr). Панкреата на плъхове ALr показва значителна периацинарна фиброза (сини оцветени ленти) и ацинарна атрофия. При CLr животни синьото оцветяване е ограничено до перидуктуларни и периваскуларни области и размерът на ацинар е нормален. Оригинално увеличение x1000.

Имунооцветяването на α гладкомускулен актин (Фигура 4) потвърждава активирането на звездни клетки на панкреаса при животни, хранени с алкохол, получаващи повторни инжекции с LPS.


Фигура 4: Ефект на етанол ± повторни инжекции LPS върху експресията на алфа гладкомускулен актин (αSMA) в панкреаса на плъх. Представителни парафинови вградени секции, имунооцветени за αSMA от плъхове, хранени с контролна диета, получаващи многократни LPS инжекции (CLr) и плъхове, хранени с алкохолна диета, получаващи многократни LPS инжекции (ALr). Панкреатите на плъховете ALr показват подчертана периацинарна имунореактивност за αSMA, което показва наличието на активирани звездни клетки на панкреаса. Оригинално увеличение x600. Антитяло: Моноклонално мише анти- α -SMA антитяло, n ° A5228 - клон 1A4, Sigma, Сейнт Луис, Мисури, САЩ.

3.0 Бележки

1. Животните от модела за хранене трябва да бъдат настанени в специално, добре проветриво помещение, изолирано от други опитни животни. Хранените с алкохол плъхове са изключително чувствителни към силни шумове, особено след инжекциите. Препоръчва се радиото да е включено по всяко време (ниска сила на звука) и да се избягват излишни посещения в стаята за животни. С животните трябва да се работи много внимателно. По-специално алкохолните плъхове са раздразнителни и лесно се стресират. Това може да доведе до липса на апетит, симптоми на отнемане на алкохол и смърт.

2. Кабелните дънни клетки се използват за предотвратяване на поглъщането на постелки или изпражнения от животните (Фигура 5). Комитетите по етика на животните могат да препоръчат някакво обогатяване на околната среда (например тунел). Всяко обогатяване на околната среда трябва да бъде направено от метал.

3. Животните, хранени с течни диети Lieber и DeCarli, не се нуждаят от допълнителна вода. Предоставената в диетата вода е достатъчна за ежедневните им нужди. Въпреки това комисиите по етични животни могат да поискат отделно водоснабдяване.

4. Според литературата течните диети на Lieber-DeCarli се използват успешно с други щамове на плъхове (напр. Плъхове Wistar). Описаният по-горе модел на плъхове обаче, доколкото ни е известно, е реализиран само с плъхове Sprague-Dawley.

5. Препоръчваме да не се използват постоянни интравенозни линии за приложение на LPS при плъхове. Последните представляват източник на дразнене и потенциална причина за инфекция за животните.

6. Моделът, описан по-горе, е приложен C57BL6 мъжки мишки (12). Нашите предварителни проучвания показаха, че този миши щам не понася концентрации на етанол от 5% v/v. Това може да се дължи на факта, че мъжките мишки C57BL6 пият по-тежко от плъховете Sprague-Dawley и/или че са особено чувствителни към ефектите на етанола. Следователно препоръчителната концентрация на етанол при алкохолната диета е 3% v/v. Алкохолът при тази концентрация заедно с интравенозния LPS възпроизвежда острите и хронични панкреатични лезии, наблюдавани при плъхове Sprague-Dawley (12; Фигура 5).


Фигура 5: (A) Изработена по поръчка клетка за администриране на течна диета при плъхове и мишки (Alain Vonlaufen, Университет в Женева, Швейцария; Indulab®, CH-9473 Gams). Епруветки за хранене и бутилки с вода се поставят отгоре на клетката. (B) Индивидуално настаняване на мишки, хранени с течни диети на Lieber-DeCarli. Мишките почиват на решетка 7x7mm (плъхове: 11x11mm). Спалното бельо се поставя в подвижна чиния под клетката.

4.0 Референции