Клара Л. Фейдер

1 Университетът на Тексас в Остин, Катедра по химия, 100 E. 24th St, Austin, TX 78712 USA

Спенсър Уди

2 Тексаският университет в Остин, Департамент по статистика и наука за данни, 2317 Speedway, Остин, Тексас 78712 САЩ

Сузана Ледет

3 Медицински център "Възнесение Сетон", Катедра по патология, 1201W. 38th St., Остин, Тексас 78705 САЩ

Jialing Zhang

1 Университетът на Тексас в Остин, Катедра по химия, 100 E. 24th St, Austin, TX 78712 USA

Катрин Себастиан

4 Университетът на Тексас в Медицинското училище в Остин Дел, Катедра по вътрешни болести, 1601 Trinity St., Остин, Тексас 78712 САЩ

Майкъл Т. Брийн

5 Университетът в Тексас в Медицинското училище в Остин Дел, Катедра за здраве на жените, 1301W. 38th St., Остин, Тексас 7870 САЩ

Ливия С. Еберлин

1 Университетът на Тексас в Остин, Катедра по химия, 100 E. 24th St, Austin, TX 78712 USA

Свързани данни

Резюме

Въведение

Резултати

Молекулно изобразяване на лезии на ендометриоза и еутопичен ендометриум

тъкани

Данни за изображения с отрицателен йон DESI-MS, получени от ендометриоза и тъкани на еутопичен ендометриум, получени от различни пациенти. (а) Избрани профили DESI-MS от ендометриалните жлези в ектопичната ендометриална тъкан, събрани от ендометриозни лезии (отгоре) и еутопична ендометриална тъкан от вътрешността на матката (отдолу). Показаните спектри са средно 10 сканирания. (б) Избрани йони на DESI-MS на ендометриоза и тъкани на ендометриума. Областите на ендометриалните жлези и стромата в рамките на лезиите са очертани в черно на оптичните изображения на H&E оцветени тъканни участъци. (° С) Изглед с голямо увеличение на ендометриозна тъкан, показващ очертани области на ендометриални жлези и строма, които пространствено корелират с разпределенията на различни молекулни йони, открити чрез изобразяване на DESI-MS, както е показано от m/z 303. 233 и m/z 723.478 показани.

Вътрешно-пациентски анализ на еутопичен ендометриум и четири тъкани на ендометриоза, събрани от яйчници, ректал, пикочен мехур и ендометриом (пациент # 98). (а) Избрани мас спектри DESI, получени от три проби, включително ендометриоза от десния яйчник и киста на яйчника (ендометриом) и еутопичен ендометриум. (б) Графики на PCA резултат от данните за пиксел, извлечени от всички тъкани на ендометриоза (жълто) спрямо тъканта на еутопичен ендометриум (черно). (° С) PCA резултати от данните за пиксел, извлечени от тъкани на ендометриоза за регион на изрязване (яйчник в оранжево; ректално в розово, пикочен мехур в зелено, ендометриом в синьо) спрямо еутопична ендометриална тъкан (черно) Елипсите се изчисляват чрез едносигма елипса (68% вероятност) от приблизително двумерно гаусово разпределение за всяка група.

Експериментите за изобразяване DESI-MS допълнително разкриха уникален масов спектър в специфични региони на много проби от лезии на ендометриоза. Въпреки че този масов спектър не е свързан с някаква конкретна хистологична характеристика, както е определено чрез хистопатологична оценка, изглежда, че се локализира в участъци от кръвни отлагания в тъканта. Масспектрите показват уникален молекулен модел от всеки друг, наблюдаван в това проучване с необичайно високо относително изобилие на йони, които обикновено не се откриват от тъканите на бозайници (допълнителна фигура S9). Йони, открити в областта с по-висока маса m/z 950–1050, са идентифицирани като n-ацилфосфатидилетаноламини (NAPE), редки сложни липиди, които се образуват, когато аминовата група на PE фосфолипидната група образува амидна връзка с мастна киселина. NAPE липидите са наблюдавани в рамките на този уникален масов спектър сред голямото количество PA, PG и PI липиди, които също са открити в останалата част от тъканната проба, въпреки че при по-ниски относителни количества.

Статистическа класификация на ендометриоза и еутопичен ендометриум с ласо

Резултати от статистически анализи, извършени върху изображения на DESI-MS. (а) Общо 98 тъкани, включително 76 тъкани с лезии на ендометриоза и 22 тъкани на еутопичен ендометриум, са били събрани проспективно от 51 различни пациенти. Изкуство предоставено от Виктория Тимошеноко/Shutterstock.com. (б) Резултати от точността на ласо на пиксел за набори от обучения, тестове и валидиране. (° С) Характеристики, избрани от ласо като дискриминационни за ендометриоза и ендометриална тъкан, където отрицателните тегла са по-показателни за ендометриозата, а положителните тегла са по-показателни за ендометриалната тъкан. (д) Характеристики, избрани чрез анализ на bootstrap на същия набор от проби, които са показателни за ендометриоза или ендометриална тъкан, където отрицателните z-резултати показват увеличаване на изобилието от ендометриоза, а положителните z-резултати показват повишено изобилие в ендометриалната тъкан.

Предимство на метода на ласо логистичната регресия е изборът на предсказващи характеристики, които допринасят най-много за класификационния модел. Избраният модел на ендометриоза се състои от 16 тъканно специфични молекули, които позволяват оптимално диференциране между тези видове тъкани с различни математически тегла, които означават техния принос към модела (фиг. 3в). Обърнете внимание, че бяха избрани общо 18 характеристики, но 2 от тях бяха определени като фонови пикове и следователно не са биологично значими. От 16-те специфични характеристики на тъканите, 5 са ​​избрани като показателни за ендометриоза, докато 11 са по-показателни за евтопична ендометриална тъкан. Списък на избраните характеристики, техните статистически тегла в модела и техните предварителни идентификации са дадени в допълнителна таблица S6 .

Избор на интересни молекулярни характеристики чрез bootstrap емпиричен Bayes анализ

Докато ласо логистичната регресия извършва избор на признаци по време на изграждането на предсказващия модел, не е задължително да избира всички характеристики в набора от данни, които се различават значително между двете групи, ако тези характеристики не подобряват класификацията. Съдейки по точността на предсказване извън извадката на окончателния избран ласо модел, изглежда, че има голямо количество сигнали за разграничаване на двете групи. Тъй като ласото благоприятства спестяването, окончателният избран набор от характеристики вероятно не обхваща напълно молекулярните разлики между групите.

Молекулярни разлики, свързани с подтипове на ендометриоза

Нашите статистически анализи бяха извършени при предположението, че всички лезии на ендометриоза ще имат сходни молекулярни модели. Въпреки това, подвидовете на ендометриоза, характеризиращи се с област на ексцизия, могат да допринесат за хетерогенност в рамките на колективните данни, както се предлага от нашите анализи за пациенти. За да се отговори на потенциала за хетерогенност поради подтипа на лезията, PCA беше извършен на всички ектопични ендометриуми. Допълнителна фигура S12 показва резултатите от PCA, с различни цветове, представляващи различни подкатегории на тъканите въз основа на тяхното местоположение в рамките на пациентите. Не се наблюдава отделяне на базата на подкатегория ендометриоза, с голямо количество данни, които се припокриват. Освен това, при фасетиране на графика на PCA, за да се изолират пиксели, произхождащи от същата проба на пациента (допълнителна фигура S13), всяко наблюдавано групиране може да бъде приписано на данни от същата тъканна проба, а не подтипове, наблюдение, което не е изненадващо, като се има предвид биологичната вариация между пациенти.

Дискусия

Извършен е PCA анализ на данните, получени от лезии на ендометриоза, за да се оцени дали получената молекулярна информация корелира с подтиповете на заболяването (допълнителна фигура S12). Ендометриозните лезии могат да бъдат разделени на три категории: яйчникова, перитонеална и дълбоко инфилтрираща ендометриоза, в зависимост от това къде е разположена лезията в тялото 52. Изследователите предполагат, че тези категории трябва да се третират като отделни единици с потенциално различни причини, симптоми и лечения 28. В нашето проучване, докато се наблюдава известно групиране в рамките на данните, получени от четири лезии на ендометриоза, събрани от един и същ пациент (фиг. 2в), PCA анализът на всички данни за изобразяване на DESI-MS, получени от лезии на ендометриоза при пациенти, не показва значително разделяне или групиране въз основа на местоположението на ексцизия. Тези резултати предполагат, че молекулярните данни, получени чрез изобразяване на DESI-MS в това проучване, не позволяват подтипиране въз основа на местоположението на тъканите при различни пациенти. Това наблюдение се подкрепя частично и от високата точност на предсказване, постигната от нашия ласо модел, при който данните бяха обединени в един клас ендометриоза.

Методи

Събиране на проби от тъкани

Лезии на човешка ендометриоза (n = 234) и еутопична ендометриална тъкан (n = 35) са били проспективно събрани от 89 пациенти, подложени както на консервативна, така и на радикална операция на ендометриоза, от д-р Майкъл Т. Брийн в Медицинското училище Dell. Тъканите бяха събрани съгласно одобрени протоколи IRB както от IRB от Тексаския университет, така и от семейството на болниците IRB от Сетон. Получено е информирано съгласие от всички пациенти, участващи в това проучване. Всички проби от лезии на ендометриоза бяха изрязани с помощта на еднополярни електрически ножици по време на лапароскопска процедура, докато пробите от еутопичен ендометриум бяха събрани само от пациенти, подложени на пълна хистеректомия с помощта на стандартен скалпел след приключване на процедурата. Пробите се съхраняват при 4 ° C в херметически затворени контейнери върху влажна марля, докато могат да бъдат замразени в течен азот, обикновено в рамките на 6 часа след изрязването. След това пробите се съхраняват във фризер, докато се разделят. Пробите от тъкани бяха разделени на участъци с дебелина 16 µm с помощта на криостат CryoStar NX50 (Thermo Scientific, Waltham, MA) и размразяване, монтирано върху предметни стъкла на микроскоп. След секционирането стъклените стъкла се съхраняват във фризер -80 ° C. Преди изображението на MS, стъклените стъкла се изсушават в ексикатор за

Химикали

Ацетонитрилът и диметилформамидът, използвани за разтворител за пръскане DESI-MS, са закупени съответно от Fisher Scientific (Waltham, MA) и Sigma Aldrich (St. Louis, MO). Всички разтворители, използвани за хистологично оцветяване, включително метанол, хематоксилин, блудиращ реагент, еозин, етанол и ксилоли са закупени от Fisher Scientific (Waltham, MA).

Изображения DESI-MS

Всички проведени експерименти са проведени в съответствие с одобрения протокол IRB. 2D система DESI (Prosolia Inc., Indianapolis, IN) беше използвана за изобразяване на тъкани с размер на пиксела от 100 µm. Изобразяването на DESI-MS се извършва в режим на отрицателни йони от m/z 100–1500, като се използва хибриден масспектрометър LTQ-Orbitrap Elite (Thermo Scientific, Сан Хосе, Калифорния) при 60 000 разделителна мощност (при m/z 200) с използване на диметилформамид: ацетонитрил 1: 3 (v/v) при скорост на потока 1,4 µL/min, освен ако не е посочено друго. Приблизителното време на сканиране беше 1,24 секунди със сценична скорост 94,3 μm/s. Получената точност на масата е 55 .

Хистопатология и светлинна микроскопия

Същите тъканни участъци, анализирани чрез изобразяване на DESI-MS, бяха оцветени, използвайки стандартен протокол за оцветяване на хемотоксилин и еозин (H&E). Патологичната оценка е извършена от д-р Suzanne Ledet. Областите на определена и вероятна ендометриална строма, ендометриални жлези и хемосидерин са разположени в лезиите на ендометриозата. Еутопичната ендометриална тъкан е потвърдена от патология и са отбелязани области, съдържащи чиста ендометриална тъкан. Светлинни микроскопични изображения на H&E оцветени диапозитиви са направени с помощта на EVOS FL Auto Cell Imaging System (Invitrogen, Thermo Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts, USA).

Идентифициране на молекулни йони

Видовете метаболит и липиди бяха идентифицирани с помощта на измервания с висока точност на масата и индуцирана от сблъсък дисоциация (CID) и индуцирана от сблъсък с висока енергия (HCD) тандемни MS анализи, извършени с помощта на Orbitrap като анализатор на масата на масспектрометъра LTQ-Orbitrap Elite. Фрагментацията беше извършена чрез растриране на източника DESI върху серийни тъканни участъци при повишена скорост на потока (3 μl/min). Използваният изолиращ прозорец беше 1 m/z с енергия, варираща от 10–30 нормализирана енергия на сблъсък за CID и 40–90 за HCD. Моделите на фрагментация са сравнени с доклади от литературата и са сравнени с данни от Lipidmaps (www.lipidmaps.org) и Бази данни за човешки метаболоми (www.hmbd.ca). Липидите се характеризират със състав на мастни киселини, но стереохимията на веригите и позицията на двойна връзка е неизвестна.

Статистически анализ

Анализът на основните компоненти (PCA) е използван за оценка на количествените разлики в данните поради подтипа. Интензитетите за всеки мас спектър бяха нормализирани от средната величина на ненулевия интензитет, за да се отчетат пикове с по-висок интензитет, показващи по-висока дисперсия, и по този начин слабо представящи общата дисперсия в спектрите 60 .