1 Неврологична служба (127C), Медицински център за ветерани, Източен Ориндж 07018; и Катедра по неврология, Медицинско училище в Ню Джърси, Нюарк, Ню Джърси 07103

1 Неврологична служба (127C), Медицински център за ветерани, Източен Ориндж 07018; и Катедра по неврология, Медицинско училище в Ню Джърси, Нюарк, Ню Джърси 07103

Резюме

При диета с ниско съдържание на мазнини чау, плъховете, склонни към индуцирано от диета затлъстяване (DIO), са повишили експресията на дъгообразно ядро ​​невропептид Y (NPY), но сходни нива на лептин в сравнение с резистентни към диета (DR) плъхове (19). Тук телесното тегло и нивата на лептин се повишиха при плъховете DIO и те защитиха по-високото си телесно тегло само след 1 седмица при диета с 31% мазнини с висока енергия (HE). Експресията на DIO NPY обаче не спада до нивата на DR до 4 седмици, когато плазменият лептин е 168% от нивата на DR. При преминаване към чау, DIO плъховете губят трупна мазнина (18). До 10 седмици нивата на лептин спаднаха до 148%, а експресията на NPY отново се повиши до 150% от нивата на DR. По време на 4 седмици ограничение на храната, DIO лептинът е спаднал с ∼50%, докато NPY се е увеличил с 30%. Докато и двамата се върнаха на контролни нива с 8 седмици, DIO плъховете все пак възвърнаха всички загубени килограми, когато се хранят ad libitum. И накрая, анорексичният ефект на интрацеребровентрикуларния лептин (10 μg) е обратно корелиран с последващо 3-седмично покачване на тегло при ВЕ диета. По този начин експресията на NPY и приема на храна са по-малко чувствителни към потискащите ефекти на лептина при плъхове DIO. Макар че това може да ги предразположи да развият DIO, това не обяснява напълно защитата им от по-високо телесно тегло при ХЕ диета.

невропептидните y (NPY) неврони в дъгообразното ядро ​​на хипоталамуса (ARC) играят критична роля в регулирането на енергийната хомеостаза в тялото (3,11, 30). NPY, освободен от тези неврони, има мощен анаболен ефект. Той увеличава приема (3), намалява термогенния капацитет (3, 32) и намалява окисляването на хранителните мазнини (25). Тези неврони съдържат лептинови рецептори (2) и тяхната експресия на NPY иРНК е обратно свързана с плазмените нива на лептин и/или лептинова сигнализация при различни условия. Краткосрочното гладуване или ограничаването на храна за до 2 седмици намалява нивата на плазмен лептин и увеличава експресията на ARC NPY (18, 19). Това увеличение може да бъде обърнато чрез централни инжекции с лептин (28).

Животни и диета.

За всички експерименти са използвани мъжки плъхове Sprague-Dawley (Charles River Labs, Kingston, NY), 300–425 g. Употребата на животни е била в съответствие с комитета за грижа за животните на Медицинския център на ветераните по въпросите на East Orange (East Orange, NJ). Животните са били хранени с пурина от Purina (№ 5001) ad libitum след отбиване и са били настанявани по 12: 12-часов график светлина-тъмнина със светлини в 1800. В зависимост от експеримента, плъховете са били хранени или с чау, или с ХЕ диета. Purina плъх чау съдържа 3,30 kcal/g с 23,4% като протеин, 4,5% като мазнини и 72,1% като въглехидрати, което е предимно под формата на сложен полизахарид (23). Диетата за НЕ се състои от 8% царевично масло, 44% подсладено кондензирано мляко и 48% пурина от Purina (Research Diets no. C11024F, New Brunswick, NJ). Съдържа 4.47 kcal/g с 21% от метаболизираното енергийно съдържание като протеин, 31% като мазнини и 48% като въглехидрати, 50% от които са захароза (23). За повечето експерименти плъховете се претеглят седмично и се измерва приемът на храна на всеки две седмици. В края на всяко проучване плъховете са обезглавени и е взета кръв в багажника за плазмени нива на глюкоза, инсулин и лептин. Епидидималните, ретроперитонеалните, периреналните и мезентериалните мастни подложки бяха отстранени и претеглени.

Експеримент 1: установяване на защитеното телесно тегло.

Фиг. 1.Група от 18 плъхове е хранена с високоенергийна (НЕ) диета за 1 седмица; 6-те с най-висок коефициент на тегло са определени като плъхове, индуцирани от затлъстяване (DIO), а 6-те с най-ниско тегло са плъхове, устойчиви на диета (DR). След това тези плъхове бяха превключени на чау за допълнителни 3 седмици.


намалена

Фиг. 2.Група от 24 плъха е хранена с НЕ диета в продължение на 2 седмици; 12-те най-високи печалби на тегло са определени като плъхове DIO, а 6-те най-ниски печалби са плъхове DR. Всички плъхове бяха превключени на чау. След това половината от плъховете DIO бяха ограничени до 50% от приема на калории през втората седмица на HE диета (Ограничаване) и телесното им тегло падна до нивото на плъховете DR в рамките на 3 дни. След това ограничените плъхове бяха хранени с чау ad libitum (Ad Lib) и всички плъхове бяха продължени на чау в продължение на общо 3 седмици на чау преди смърт.


Фиг. 3.Група от 24 плъхове е хранена с HE с диета в продължение на 4 седмици, а 12-те най-високи набиращи тегло са определени като DIO плъхове и 6-те най-ниски като DR плъхове. По това време всички плъхове бяха превключени на чау и половината от DIO плъховете бяха ограничени до 50% от приема на калории през 4-тата седмица на HE диета. Телесното тегло на ограничените плъхове спадна до нивата на DR в рамките на 1 седмица. След това бяха хранени с чау ad libitum и всички плъхове бяха продължени с чау в продължение на общо 3 седмици преди смъртта.

Експеримент 2: Връзка между ARC NPY иРНК и плазмен лептин.

Експеримент 3: Връзка между индуцираната от лептин анорексия и развитието на DIO.

ARC NPY иРНК in situ хибридизация.

Плазмени нива на лептин и инсулин.

Концентрациите на лептин и инсулин в плазмата се определят чрез радиоимуноанализи (Linco, St. Charles, MO), като се използват антитела съответно на автентичен инсулин от плъх и лептин, съответно.

Химикали и реактиви.

Освен ако не е посочено друго, всички химикали и реагенти са закупени от Sigma (Сейнт Луис, Мисури).

Статистика.

Междугруповите сравнения бяха направени чрез еднопосочен ANOVA за увеличаване на телесното тегло, плазмен лептин и ARC NPY експресия на иРНК. В проучванията за вливане на лептин инхибирането на приема, произведено от интрацеребровентрикуларен лептин, се сравнява с последващото наддаване на телесно тегло на това животно при ХЕ диета в продължение на 3 седмици чрез тест на корелационния коефициент на Пиърсън. Също така, плъховете DR и DIO са идентифицирани ретроспективно чрез увеличаване на теглото след 3 седмици на HE диета (23). След това се изчислява процентното инхибиране на приема от лептин спрямо aCSF за всяко животно на 4 и 24 часа. Тези резултати бяха сравнени от ANOVA за многократни измервания. След установяване на значителна междугрупова разлика действителният прием при същите плъхове между aCSF и лептин се сравнява чрез еднопосочен ANOVA за 4 и 24 часа. Когато бяха открити значителни разлики (P≤ 0,05), бяха проведени множество тестове за сравнение на post hoc Scheffé.

Експеримент I: установяване на защитеното телесно тегло.

В този експеримент плъховете са били подложени на поредица от диетични манипулации, за да се установи кога DIO плъховете ще приемат и поддържат по-високите си телесни тегла след излагане на ВЕ диета. След само 1 седмица на HE диета (Фиг. 1; Таблица 1), телесното тегло на шестте най-високи тегловци (DIO плъхове) не се различават значително от тези на шестте най-ниско спечелени (DR плъхове). Въпреки това, когато се вземе предвид наддаването на телесно тегло, плъховете DIO наддават значително повече тегло (63 ± 6 g), отколкото плъховете DR [36 ± 5 g; F(1,10) = 4,62;P = 0,025] след 1 седмица на ВЕ диета. След това те преминаха на диета с ниско съдържание на мазнини в продължение на 3 седмици. След 3 седмици на чау, телесното им тегло е сравним, но общото тегло на мазнините е 51% по-високо, нивото на инсулин в плазмата е 102% по-високо, а нивото на лептин е 96% по-високо от DR плъхове, преминали към чау. Към този момент площите на ARC NPY иРНК чрез in situ хибридизация бяха сравними при DIO (0,525 ± 0,079 mm 2) и DR плъхове (0,462 ± 0,070 mm 2). По този начин 1 седмица излагане на НЕ диета беше достатъчна, за да се установи по-високо наддаване на телесно тегло и да се настроят плъховете по траектория на повишено затлъстяване на трупа, плазмен лептин и нива на инсулин. Важно е, че с нивата на лептин при 196% от контролите на DR, експресията на mIO РНК на DIO ARC NPY се нормализира до нивата на DR.

Таблица 1. Тегло на крайното тяло и общите мазнини, нивата на инсулин в плазмата и нивата на лептин за плъхове, хранени с НЕ диета за 1 седмица и след това превключени на чау в продължение на 3 седмици

Стойностите са средни стойности ± SE. Общо 18 плъхове бяха поставени на високоенергийна (НЕ) диета за 1 седмица. 6-те най-високи и 6 с най-ниско повишаване на теглото са определени съответно като плъхове, предизвикани от диета (DIO) и резистентни към диета (DR). След това тези 12 плъхове бяха превключени на чау в продължение на 3 седмици и теглото на окончателното им телесно тегло (BWf) и епидидима (Epi), ретроперитонеално (RP), периренално (PR) и мезентериално (Mes) натрупване на мазнини бяха оценени заедно с кръвта в багажника нива на инсулин и лептин.

* P ≤ 0,05 за даден параметър в DIO в сравнение с DR плъхове ст-тест. Phen, фенотип.

След 2 седмици на ХЕ диета (фиг. 2), 12-те най-високи DIO плъхове с наддаване на тегло са били с 12% по-тежки (448 ± 7 g) от 6-те плъхове DR с най-ниско тегло (402 ± 3 g; P = 0,01). Когато и двете DIO и DR плъхове бяха превключени на чау и подгрупа от шест DIO плъхове беше ограничена до 50% от базовия прием на ХЕ диета, телесното им тегло падна до нивото на DR плъхове в рамките на 3 дни. Когато им бъде разрешен прием ad libitum отново, тези плъхове възстановяват телесното тегло на неограничените DIO плъхове в рамките на 1 седмица. След 4 седмици на HE диета, 12-те най-високи DIO плъхове с наддаване на тегло бяха 10% по-тежки (572 ± 11 g) от 6-те плъхове DR с най-ниско тегло (520 ± 14 g; P = 0,01) (Фиг. 3). Това възлиза на 67% по-голямо нарастване на телесното тегло от плъхове DIO спрямо DR през тези 4 седмици. Когато всички плъхове бяха превключени на чау след 4 седмици на HE диета и шест DIO плъхове бяха ограничени до 50% от техния изходен калориен прием на HE диета, телесното тегло на ограничените плъхове спадна до тези на DR плъхове в рамките на 1 седмица. Както при плъховете, изследвани след 2 седмици на ХЕ диета, тези от 4-седмичната група възвърнаха телесното тегло на неограничени DIO плъхове в рамките на допълнителни 1 седмици от ad libitum достъп до чау.

Експеримент 2: Връзка между ARC NPY иРНК и плазмен лептин.

Оригиналните данни, представени тук, са за плъхове, хранени с HE диета за 1, 2 и 4 седмици (всички данни) и за ARC NPY експресия на иРНК в мозъка на плъхове, хранени с HE с диета за 12 седмици и след това превключени на чау за допълнителни 10 седмици ( Таблица2; Фиг.4) (20), както и за DIO плъхове от това проучване, които са били съобразени с телесното тегло на плъховете DR за 8 седмици (Таблица 3) (20). Таблици 2 и 3 и фиг. 4 обобщават телесното тегло, плазмен лептин и инсулин, както и допълнителни точки от данните ARC NPY от преди публикувани проучвания (18-20, 24). Когато се хранят с чау след отбиване, плъховете, склонни към DIO, тежат по същия начин и имат същата маса на мастна тъкан и нива на лептин като плъховете, склонни към DR. Въпреки това техните нива на ARC NPY са били с 38% по-високи от плъховете, склонни към DR (19). След 1 седмица на HE диета, DIO стана 3% по-тежък. Въпреки че общото тегло на четири мастни депа не се различава, тези DIO плъхове имат 37% по-високи нива на плазмен лептин от плъховете DR (Таблица 2; Фиг. 4). Въпреки това, тяхната ARC NPY експресия все още е 34% по-висока от нивата на DR. След 2 седмици на HE, плъховете DIO бяха с 6% по-тежки и имаха 69% по-тежки мазнини и 37% по-високи нива на лептин. Отново тези промени бяха недостатъчни за намаляване на експресията на ARC NPY, която остана с 34% по-висока от DR плъховете.

Таблица 2. Обобщение на теглото на тялото и мастната тъкан, нивата на плазмен лептин и експресията на иРНК на ARC NPY

Стойностите са средни стойности ± SE. Групи от 6–8 плъхове DIO и DR бяха хранени с ВЕ диета за 1, 2, 4 или 12 седмици [тегло на тялото и мастната тъкан, плазмен лепин и дъгообразно ядро ​​(ARC): данни за невропептид Y (NPY) за 0- и 2-седмичната група са от Реф. 19 и 12-, 14- и 16-седмични групи са от Реф. 18 и 24]. Хранените с чау плъхове при 0 седмици са определени като склонни към DR спрямо DIO склонни, съответно от ниските и високите нива на норепинефрин в урината (19). 22-седмичните плъхове бяха разделени на 12 DIO и 12 DR плъхове въз основа на съответното им наддаване на тегло след 12 седмици на ВЕ диета. Към този момент всички плъхове бяха превключени на чау за допълнителни 10 седмици (теглото на тялото и мазнините и нивата на плазмен лептин са от Реф. 20).

* P ≤ 0,05, когато DIO плъхове са сравнени с DR плъхове от т-тест.

Фиг. 4.Обобщение на връзката между експресията на мРНК на дъгообразно ядро ​​(ARC) невропептид Y (NPY) и едновременните нива на плазмен лептин при плъхове DIO, взети от настоящото и предишни (18-20, 24) проучвания. Данните са средни стойности ± SE проценти на съпоставими групи от плъхове DR в различни моменти от време по време на приема на НЕ диета за 12 седмици и след това чау за допълнителни 10 седмици. + P ≤ 0,05, когато експресията на DIO ARC NPY е сравнена с DR плъхове; * P ≤ 0,05, когато нивата на DIO плазмен лептин са сравнени с DR плъхове.

Таблица 3. Връзка на плазмения лептин с ARC NPY експресията на иРНК по време на ограничаване на приема на храна при плъхове DIO

Стойностите са средни стойности ± SE. Тези данни са получени от 3 публикувани преди това проучвания. Една група от 5 плъхове е определена като DIO склонна от техните повишени 24-часови нива на норепинефрин в урината и след това е ограничена до 50% от изходния им прием на чау в продължение на 5 дни (19). Допълнителна група от 6 плъхове е затлъстяла чрез прием на НЕ диета за 12 седмици. Те бяха превключени на чау в продължение на 2 седмици и след това бяха ограничени до 50% от базовия им прием за 2 седмици (18, 24). Последна група от 12 плъхове е била затлъстела по време на HE диета в продължение на 12 седмици. Те бяха превключени на чау за 2 седмици и след това ограничени до 50% от базовия им прием за 8 седмици (20).

F3-150 P ≤ 0,05, когато стойностите за областите на плазмен лептин и ARC NPY чрез in situ хибридизация при тези DIO плъхове с ограничена диета бяха сравнени с DR контролите, хранени с чау ad libitum. Всички данни с изключение на зоната NPY за 8-седмичните ограничени DIO плъхове са публикувани преди това (18-20, 24).

Експресията на ARC NPY при плъхове DIO остава по-висока, отколкото при плъхове DR, докато плъховете DIO не са били изложени на HE диета в продължение на 4 седмици (Таблица 2; Фиг. 4). По това време DIO плъховете бяха с 10% по-тежки и имаха 110% по-тежки мазнини и 68% по-високи нива на лептин от плъховете DR. Въпреки това, след 12 седмици на HE диета, DIO плъховете поддържат 16% по-високо телесно тегло и имат 173% по-тежки мастни депа и 79% по-високи нива на лептин (24). Към този момент тяхната ARC NPY експресия всъщност е била с 17% по-ниска от DR плъховете (18). И накрая, когато сравними плъхове бяха затлъстели след 12 седмици на ХЕ диета и след това преминаха на чау в продължение на 10 седмици, те поддържаха 15% по-тежко телесно тегло, докато тяхната маса на мастната подложка спадна до 153% и техният лептин спадна до 148% от нивата на DR (20). Във връзка с това намаляване на плазмените нива на лептин, експресията на ARC NPY нараства до 58% по-висока от сравними плъхове DR (Таблица 2; Фиг. 4). По този начин плазменият лептин под 150% от нивата на DR е свързан с повишаване на експресията на ARC NPY mRNA при плъхове DIO.

Експеримент 3: Връзка между индуцираната от лептин анорексия и развитието на DIO.

Интравентрикуларното приложение на 10 μg лептин е по-малко ефективно за намаляване на 4-часовия прием на чау при плъхове със склонност към развитие на DIO върху HE. По този начин е налице значителна обратна връзка между индуцираното от лептин инхибиране на приема на чау на 4 часа и последващото наддаване на телесно тегло на това животно в продължение на 3 седмици при ХЕ диета (Фиг. 5Б.; r = 0,71;P = 0,014; 95% доверителни интервали: наклон: от -2,10 до -0,24; у-прихващане: 20,3 до 75,6). Няма такава връзка между инхибирането на 24-часовия прием и последващото наддаване на тегло. Когато 11-те плъхове, завършили целия протокол, бяха разделени ретроспективно на DR (н = 4; Групи с 20% наддаване на тегло) според наддаването на тегло над 3 седмици на HE диета, плъхове, склонни към DR, показват значително по-голямо индуцирано от лептин инхибиране на приема както на 4, така и на 24 h в сравнение като процент от приема им след aCSF при същите интервали от време [F(1,9) = 5,74; P = 0,03]. Когато се сравняват абсолютните приеми, само плъховете, склонни към DR, показват значително инхибиране на 4-часовия прием (35,5 ± 6,2%) в сравнение с aCSF (Фиг. 5A). Leptin също има тенденция да има по-голям абсолютен инхибиторен ефект върху 24-часовия прием при DR (43,2 ± 7,7%), отколкото при плъховете DIO (26,6 ± 7,8%; P = 0,1).

Фиг. 5.Хранените с чау плъхове се гладуват в продължение на 24 часа и след това се инжектират в страничната камера с изкуствена цереброспинална течност (aCSF) или 10 μg лептин. Приемът им на храна се измерва на 4 и 24 часа след инжектирането. След това плъховете бяха поставени на ВЕ диета за 3 седмици и разделени на наддаване на тегло през този период на DIO (> 20% наддаване) или DR (

Лептинът обикновено инхибира ARC NPY експресията (26, 28). Настоящите проучвания, направени в контекста на предишните ни проучвания (18-20, 24), предполагат, че предразположените към DIO плъхове имат намалена чувствителност към този инхибиторен ефект. Експресията на NPY е повишена при DIO-склонни плъхове, които имат нормални нива на лептин (18,19, 24) и не спадат до нивата на DR, докато плазмените нива на лептин не са почти 70% по-високи от DR плъховете. Когато нивата на лептин достигнат 180% от нивата на DR след 12 седмици на HE диета, експресията на ARC NPY всъщност е намалена с 25% (18, 24). В този момент, когато плъховете DIO са преминали на диета с ниско съдържание на мазнини, телесното им тегло е плато, докато теглото на мастните подложки и нивата на плазмен лептин падат бавно за 10 седмици (20, 24). След като DIO плазмен лептин падна до 50%. Експресията на ARC NPY отново се повишава, тъй като DIO плъховете губят трупни мазнини и нивата на лептин падат под прага от 50% при диета с ниско съдържание на мазнини. В допълнение, DIO-склонните плъхове показват намалена чувствителност към аноректичните ефекти на централно администрирания лептин. Това предполага причинно-следствена връзка между намалената лептинова чувствителност, свръхекспресията на ARC NPY и ранното наддаване на тегло и защита на затлъстяване при плъхове, склонни към DIO, когато хранителните мазнини и калоричното съдържание се повишат. Това обаче не обяснява напълно тяхната защита на по-високо телесно тегло.

Перспективи

Очевидно лептинът и NPY не са цялата история. Хронично ограничените с храна DIO животни бързо възвръщат загубеното си тегло с неограничено хранене в присъствието на нормални нива на ARC NPY и плазмен лептин. По подобен начин животните с аномалии в сигналните пътища за лептин регулират телесното си тегло на по-високи нива (12). В такива случаи други мастни киселини фактори или инсулин могат да действат като втора, но по-малко ефективна линия на защита. Лептинът, инсулинът, глюкозата и други метаболитни сигнали се усещат от специализиран клас метаболитно чувствителни неврони в мозъка (22). В допълнение към дефектната лептинова сигнализация, DIO плъховете имат и няколко дефекта в централната глюкоза, медиирани от тези метаболитни сензорни неврони (22). По този начин DIO плъховете, подобно на генетично затлъстелите плъхове Zucker (1, 9, 10, 29, 33), могат да имат генетично програмирана височина в своя праг за много хранителни и хормонални сигнали за обратна връзка. Когато има достатъчно храна, такива плъхове увеличават запасите си от мазнини, докато тези сигнали се повишат над този повишен праг на откриване. Това предсказва, че такива животни (и хората) ще регулират и защитават своята енергийна хомеостаза най-добре при такова повишено ниво и би могло да обясни голямата трудност при намаляване на телесното си тегло чрез диета.

Благодарим на C. Salter, A. Moralishvilli, O. Gordon и G. Zhou за техническа помощ.

СТЪПКИ

Тази работа беше подкрепена от Националния институт по диабет и храносмилателни и бъбречни болести безвъзмездна помощ RO1–30066 и Службата за научни изследвания към Министерството на ветераните.

Адрес за заявки за повторно отпечатване и друга кореспонденция: Б. Е. Левин, Неврологична служба (127C), VA Medical Center, 385 Tremont Ave., E. Orange, NJ 07018-1095 (E-mail: [email protected] edu).