Редактирано от Pierre Chambon, I.G.B.M.C., Страсбург, Франция и одобрено на 4 август 1999 г. (получено за преглед на 11 юни 1999 г.)

матка

Резюме

Биологичните роли на естроген-реагиращия пръстен протеин (efp) in vivo бяха оценени при мишки, носещи мутация на загуба на функция в efp чрез генно-насочена мутагенеза. Въпреки че efp хомозиготните мишки са жизнеспособни и плодородни и при двата пола, матката, която експресира изобилен естрогенен рецептор α, показва значително недоразвитие. Когато овариектомизираните хомозиготи бяха подложени на лечение с 17β-естрадиол, те показаха забележимо отслабени отговори на естроген, илюстрирани чрез намалено имбибиране на интерстициална вода и забавено увеличаване на клетките на ендометриума, което се дължи на по-ниското съотношение на G1 към прогресията на S-фаза в епитела клетки. Тези резултати предполагат, че efp е от съществено значение за нормалната индуцирана от естроген клетъчна пролиферация и подуване на матката като една от преките цели на естрогенния рецептор α.

Материали и методи

efp стратегия за насочване на гени и генериране на нокаут мишки.

График за животни и инжекции за оценка на реакцията на естроген.

Възрастни женски F2 бяха овариектомизирани на ден 0 и бяха третирани със 17β-естрадиол (E2) (20 μg/kg/ден) или зехтин (контрол на разтворителя) от ден 28 до ден 30, и всяко маточно мокро тегло от третирано с E2 диво тип мишки (+/+) (n = 11), хетерозиготи (+/−) (n = 11), хомозиготи (-/-) (n = 11) и нетретирани с E2 мишки бяха измерени на 31 ден Изчислено е съотношението на мокрото тегло (милиграма) към телесното тегло (грамове). След това бяха генерирани замразени срезове от всеки образец за хистологичен анализ. Впоследствие, за да се проследи поглъщането на течности, възрастни женски F2 бяха овариектомизирани на ден 0 и бяха третирани с E2 (20 μg/kg/ден) или зехтин (контрол на разтворителя) от ден 28 до ден 30, както е описано по-горе, и след това маточна вода имбибиция и сухо тегло от третирани с Е2 мишки от див тип (+/+) (n = 6), хомозиготи (-/-) (n = 6) и мишки, които не са третирани с Е2, бяха измерени на ден 31. от животни се разрязват надлъжно и се попиват, за да се отстрани луминалната течност, след което органите се инкубират в пещ с температура 60 ° С за 1 ден и се претеглят накрая. Разликата между мокро и сухо тегло позволява да се определи водното поглъщане и съответно се изчислява съотношението на попиване на вода и сухо тегло (милиграма) на матката към телесното тегло (грамове).

График за животни и инжекции за експеримент за етикетиране на BrdUrd.

Възрастни женски F2 бяха овариектомизирани на ден 0 и бяха третирани с Е2 (2 μg/kg) или зехтин (контрол на разтворителя) в продължение на 12 h на ден 28. Животните получиха интраперитонеална инжекция на BrdUrdrd (30 mg/kg) 2 часа преди бидейки убит. In vivo маркирането на BrdUrd се извършва чрез интраперитонеално инжектиране на BrdUrd, както е описано (35). След това всяка матка от третирани с Е2 мишки от див тип (+/+) (n = 8), хомозиготи (-/-) (n = 8) и мишки, които не са третирани с Е2, бяха разделени напречно на три порции. Впоследствие три съответни замразени участъка от матката бяха имунооцветени с анти-BrdUrd моноклонално антитяло и беше изчислена средна стойност на BrdUrd-позитивните епителни клетки в тях. Индексът на BrdUrd за маркиране най-накрая беше изчислен като процент на отбелязани BrdUrd-положителни епителни клетки в цели епителни клетки, оцветени с 4 ', 6' диамино-2-фенилиндол и бяха отбелязани най-малко 400 клетки.

Анализ на Северно петно.

За всяка проба, 5 μg Poly (A) + РНК от матката на див тип (+/+), хетерозиготни (+/−) и хомозиготни (-/-) мишки бяха разделени в 1% агароза. Анализът на Northern blot се извършва, както е описано (36). 32-белязаният 1.3-kb EcoRI-XhoI фрагмент, включващ повечето навита намотка и С-терминалната област, но не RING домейнът на пръста на cDNA на мишката efp (24) или cDNA на глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназата, беше използва се като сонда. Авторадиографията се извършва при -80 ° C с усилващ екран за 3 дни с мишка efp cDNA сонда и за 1 ден с глицералдехид-3-фосфат дехидрогеназа cDNA сонда.

Приготвяне на ядрени екстракти и анализ на Western Blot.

Ядрените екстракти се приготвят от матката от див тип (+/+), хетерозигота (+/−) и хомозигота (-/-), както е описано (37). Тридесет микрограма ядрен екстракт се отделят чрез електрофореза върху 15% SDS полиакриламиден гел. Имуноблотираната мембрана реагира с антимиши efp антитела (24) (1: 5000), третира се с анти заешки IgG (Fc), конюгиран с хрянова пероксидаза (HRP) (1: 7500) и след това се открива с помощта на ECL реагенти за откриване (Amersham Pharmacia).

Имунохистохимия.

Имунохистохимията се извършва, както е описано (36). Замразени участъци на матката от 8-седмична ICR мишка реагираха с помощта на антимиши efp антитела (24). Впоследствие реагираха биотинилирани анти-заешки IgG антитела и бяха добавени хрян пероксидаза (HRT) -стрептавидин и субстратен разтвор. След това срезовете бяха леко оцветени с хематоксилин. В допълнение, за оценка на индекса на BrdUrd за маркиране се генерират замразени участъци на матката от всеки генотип (+/+, -/-), третирани с BrdUrd, и след това имунофлуоресценция, използвайки анти-BrdUrd моноклонално антитяло (Caltag, South San Francisco, CA) се извършва, както е описано (35). Те бяха оцветени с антимиши IgG (Jackson Immuno-Research) с FITC и бяха вградени в 25% глицерол с 4 ', 6' диамино-2-фенилиндол (Sigma).

Резултати

efp хомозиготни мутанти изглежда растат нормално, без да показват очевиден външен дефект във фенотипа. Те дори бяха плодородни и за двата пола. Поради това изследвахме целевите органи за естроген при F2 животни с чист генетичен произход 129 SV. Първо инспектирахме размера на маточния рог и теглото на 10-седмично потомство от F2. Редица матки в секреторната фаза на менструалния цикъл бяха събрани от потомство F2 чрез проверка на вагиналната цитонамазка. Матките на хомозиготни мишки са значително по-малки (фиг. 2А), показващи съотношението на теглото на матката към телесното тегло с 36% по-ниско от това на мишки от див тип (фиг. 2Б), въпреки че няма значителна разлика в цялото телесно тегло между тях. Обаче не е открита хистологична аномалия при оцветяване на хематоксилин и еозин в маточните клетки на хомозиготни мишки (данните не са показани). Матките в хетерозиготите също са склонни да бъдат по-малки, но разликата от мишките от див тип не е статистически значима (Фиг. 2Б). Съществува възможност хаплоинсуфициентността на efp да повлияе до известна степен на развитието на матката. За разлика от това, теглото на черния дроб при F2 животни е приблизително същото (данните не са показани).