Редактиран от W. Maxwell Cowan, Медицински институт на Хауърд Хюз, Chevy Chase, MD, и одобрен на 17 декември 1999 г. (получено за преглед на 29 октомври 1999 г.)

инхибиторни

Резюме

Невроналният апоптозен инхибиторен протеин (NAIP) е член на ново семейство инхибитори на апоптозни протеини (IAP). IAP гените са силно консервирани от бакуловирус до метазои и потискат апоптозата, индуцирана от различни тригери, както in vitro, така и in vivo. Тук описваме генерирането и характеризирането на мишки с целевото изтриване на NAIP1. Ние демонстрираме, че изтритите от NAIP1 мишки се развиват нормално. Обаче оцеляването на пирамидалните неврони в хипокампуса след индуцирани от каинова киселина лимбични припадъци е значително намалено при нокаутираните животни NAIP1. По този начин, въпреки че NAIP1 не е необходим за нормалното развитие на мишата централна нервна система, ендогенният NAIP1 е необходим за оцеляване на невроните при патологични състояния.

Апоптозата играе критична роля в регулирането на клетъчната смърт в периферната и централната нервна система (ЦНС) както във физиологичните условия, така и при неврологичното заболяване. Дисрегулирането на апоптозата се проявява при хронични невродегенерации като болестта на Алцхаймер, амиотрофична странична склероза, болестта на Паркинсон, както и при епилепсия и исхемия (1). Спиналната мускулна атрофия (SMA) е невродегенеративно разстройство, характеризиращо се с прогресивно загуба на двигателни неврони на гръбначния мозък. Наскоро предложихме връзка между неподходяща апоптоза и модулация на тежестта на SMA. Ние показахме, че инхибиторният протеин на невроналната апоптоза (NAIP) се заличава при значителна част от пациентите с SMA (2). Функционален NAIP в пълна дължина отсъства при повечето индивиди с тип I SMA и съществува тясна връзка между регионалното разпределение на NAIP в ЦНС и невродегенеративните промени в SMA (3). Тези наблюдения са в съответствие с невродегенеративния характер на SMA. Въпреки че се смята, че причинителният ген, участващ в SMA, е генът SMN (двигателен неврон за оцеляване) (4), се предлага ролята на NAIP в SMA да бъде модулираща, влошаваща тежестта на заболяването (5).

Генът NAIP е член на наскоро идентифицирано семейство от вътрешни клетъчни регулатори на апоптоза, инхибитор на апоптоза (IAP) генно семейство (6). IAP гените първоначално са открити в бакуловируси, но оттогава техните хомолози са идентифицирани при други вируси, насекоми, птици и бозайници, което предполага общ еволюционен произход (7). Забележително е, че IAP протеините потискат апоптозата, предизвикана от разнообразие от тригери, което е по-голямо от това, съобщено за други антиапоптотични гени, включително семейството bcl-2 (8). Счита се, че начинът на действие на IAP гените е чрез директно свързване и инхибиране на ключовите каспази и прокаспази (предимно каспаза 3 и 7) (9–12). Показателно е, че показахме, че преходната исхемия на предния мозък селективно повишава нивата на NAIP в невроните, които са устойчиви на исхемично увреждане. Освен това, извънматочната свръхекспресия на NAIP в атенюираната невронална увреда на ЦНС, причинена от преходна исхемия на предния мозък, предполага, че NAIP играе ключова роля в невропротекцията (13).

Ролята на IAP гените в контрола и модулацията на програмираната клетъчна смърт е изведена главно от експериментите in vitro. In vivo физиологичните роли на ендогенните IAP гени са по-малко ясни поради липсата на данни от нокаут моделите. В настоящата статия ние описваме генерирането и характеризирането на нокаутираните мишки NAIP1. Ние показваме, че мишките с целенасочено заличаване на Naip1 са морфологично нормални и не показват никакви характеристики на SMA. Изтриването на Naip1 обаче води до повишена чувствителност на хипокампалните пирамидални неврони към апоптотична смърт, причинена от епилептични припадъци, индуцирани от каинова киселина (KA). Нашите данни показват, че ендогенните, физиологични нива на NAIP1 играят критична роля в невропротекцията.

Материали и методи

Поколение на Naip1 -/- Мишки.

Индукция на лимбични припадъци.

KA (Aldrich Chemical, Milwaukee, WI) се разтваря в 10 mM PBS и се прилага от i.p. инжекция. В предварително проучване е установена доза от 45 mg/kg като достатъчна за предизвикване на припадъчна активност при> 95% от мишките със статистически пакет sigmaplot (Jandel Scientific, San Rafael, CA).

Резултати и дискусия

Схематична диаграма на целевото разрушаване на гена Naip1 при мишки. (А) Показана е структурата на 5 ′ края на локуса Naip1 на мишката, насочен вектор pKO.naip1 и насочения алел Naip1. Плътните кутии показват екзони; местата за ограничаване са обозначени с вертикални черни линии (E, EcoRI; RV, EcoRV; S, SstI). Позицията на сондата, използвана за геномния анализ на Southern blot, се обозначава с черната кутия, а позициите на праймерите за обратна транскрипция-PCR се обозначават със стрелки. (B) Анализът на Southern blot на усвоената с EcoRI геномна ДНК от ембрионални стволови клетки показва наличието на насочените (4.8 kb) и алелите от див тип (7.5 kb). (C) Анализ на Southern blot на усвоена с EcoRI геномна ДНК от хомозиготни мутанти (-/-), хеторозиготни (+/−) и мишки от див тип (+/+) Naip1 (линия 249). (D) Обратна транскрипция-PCR анализ на мозъчна иРНК за Naip1-нулеви и див тип мишки. Naip1-специфични PCR праймери (21) бяха използвани за амплифициране на Naip1 cDNA между екзони 1 и 4. 200-nt фрагмент от актин беше амплифициран като положителен контрол.

Мишките Naip1 -/- изглеждаха нормални и не показаха последователни хистологични или морфологични аномалии. Външен вид, съотношения на пола, размер на постелята и наддаване на тегло на Naip1 -/- мишките бяха подобни на техните Naip1 +/+ поколения. В допълнение, размерите на мозъка не се различават между двете групи животни, което предполага, че няма брутна невронална загуба (Таблица 1). И накрая, задълбочено изследване на поведението и пространственото обучение, включително тестове за сензорна и двигателна функция, 24-часова активност, тестове за рото пръчици, тест за вода на Морис и изграждане на гнездо не разкриха значителни разлики между Naip -/- животните и техния див тип отпадъци (данните не са показани). Тези резултати показват, че целенасоченото нарушаване на Naip1 няма никакъв неблагоприятен ефект върху развитието и правилната функция на ЦНС на мишката. Наличието на множество Naip хомолози при мишки прави невъзможно да се разбере дали наблюдаваната функционална излишност се предава от останалите непокътнати Naip локуси, гени, които не са NAIP, или комбинация от тях.

Ефектът от целенасоченото изтриване на гена Naip1 върху избрани параметри

За да проверим хипотезата, че Naip1 е необходим за невронална апоптотична резистентност, ние подложихме Naip1 -/- и мишки от див тип на един i.p. инжекция на KA (45 mg/kg). KA произвежда лимбични припадъци със съпоставим интензитет, независимо от състоянието им на Naip1 (Таблица 2), което предполага, че механизмът, в основата на който се крие припадъкът, е независим от Naip1. ISEL-положителни ядра са наблюдавани само в пирамидални неврони на подполето CA3 в хипокампуса и в двете групи животни, а останалата част от ЦНС изглежда нормална. За разлика от сходните резултати за припадъци, имаше забележима разлика в нивото на невронална смърт, както е показано от фрагментацията на ДНК с 2,5-кратно увеличение на броя на ISEL-позитивни клетки, наблюдавани при Naip1 -/- мишки в сравнение с техните диви тип отпадъци (фиг. 2).

Ефектът на Naip1 делеция върху тежестта на гърчовете след приложение на каинат