Резюме

ОБЕКТИВЕН-Ендогенната експресия на аполипопротеин Е (апоЕ) има значително влияние върху метаболизма на адипоцитните липиди и е значително потисната при затлъстяване. Оксидантният стрес на мастната тъкан се очертава като важен медиатор на дисфункция на адипоцитите. Тези проучвания са предприети, за да се оцени ролята на оксидантния стрес за регулиране на адипоцитния апоЕ.

стрес

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯ -Експресията на ApoE ген и протеин в 3T3-L1 адипоцити или зрели адипоцити и мастна тъкан от мишки C57/BL6 беше оценена след индукция на оксидантен стрес. Отговорът на мастната тъкан и адипоцитите от затлъстяване в сравнение с постни мишки към антиоксиданти също беше оценен.

РЕЗУЛТАТИ—Оксидантният стрес в 3T3-L1 клетки или адипоцити и мастна тъкан от постни мишки значително намалява апоЕ mRNA и нивото на протеин. Включването на антиоксидант елиминира това намаляване. Оксидантният стрес е придружен от активиране на транскрипционния комплекс на ядрения фактор-кВ (NF-кВ) и ефектът му върху апоЕ е елиминиран от инхибитор на активиране на NF-кВ. Лечение на прясно изолирана мастна тъкан или зрели адипоцити от затлъстели мишки с антиоксидант, повишена експресия на апоЕ, но няма ефект върху клетки или тъкан от постни мишки. Инкубацията на прясно изолирани адипоцити от постни мишки със стромоваскуларни клетки от затлъстели мишки значително потиска аподезата на адипоцитите в сравнение с инкубацията със стромоваскуларни клетки от постни мишки, но това потискане е обърнато чрез включване на антиоксидант или неутрализиращо антитяло към фактор туморна некроза-α.

ЗАКЛЮЧЕНИЯ—Оксидантният стрес значително модулира експресията на мастната тъкан и апоЕ на адипоцитите. Освен това, оксидантният стрес допринася за потискане на адипоцитния апоЕ при затлъстяване. Това потискане зависи от взаимодействието между стромоваскуларните клетки на мастната тъкан и адипоцитите.

Затлъстяването е широко признато като все по-разпространена причина за метаболитни и сърдечно-съдови заболявания (1,2). Също така наскоро беше оценено, че затлъстяването е свързано с хронична възпалителна реакция в мастната тъкан и че това възпаление е тясно свързано с метаболитен и сърдечно-съдов риск (1,3,4). Мастната тъкан от затлъстели животни или хора се характеризира с приток на възпалителни клетки, предимно макрофаги, в нейното стромоваскуларно отделение с повишено местно производство на провъзпалителни цитокини (5-8). Съществува и съпътстващо увеличаване на производството на реактивни кислородни видове (ROS) в мастната тъкан (9). Локализираното възпаление с оксидативен стрес в мастната тъкан води до важни промени в експресията на адипоцитни гени с последващи ефекти върху метаболизма на адипоцитните липиди и съдържанието на триглицериди. Възпалението на мастната тъкан и оксидантният стрес също водят до системно увеличаване на циркулиращите възпалителни цитокини и ROS с неблагоприятни ефекти върху системното действие на инсулина и метаболизма на субстрата (1,9,10).

Зрелите адипоцити и макрофаги експресират редица общи протеини и един от тях е аполипопротеин Е (апоЕ). В макрофагите ендогенната експресия на апоЕ функционира главно за улесняване на липидния поток (11,12). Полученият от макрофаги апоЕ в артериалната стена също е свързан с локални противовъзпалителни и антиоксидантни ефекти (13–15). ApoE също е силно експресиран в хепатоцити и стероидогенни клетки (16–18). Подобно на макрофагите, тези два типа клетки изпитват висок липиден поток, свързан съответно с диференцираните им функции на метаболизма на липопротеините и секрецията на стероидни хормони. Адипоцитите също изпитват висок липиден поток като част от диференцираната си функция и експресията на апоЕ на високо ниво е забелязана за първи път от Zechner et al. (19). Съвсем наскоро беше установена важна роля за ендогенно експресираните апоЕ на адипоцитите за модулиране на метаболизма на адипоцитните липиди и липопротеини (20).

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Средата за клетъчни култури, фетален говежди серум (FBS) и антибиотици са закупени от Invitrogen (Carlsbad, CA). Полученият от коза апоЕ антисерум е от International Immunology (Murrieta, Калифорния). Фосфо-инхибиторът на κBα (фосфо-IκBα) и IκBα антитела са от Cell Signaling Technology (Danvers, MA). TNF-a неутрализиращото антитяло е от Biovision (Mountain View, Калифорния). Инхибиторът на активиране на ядрения фактор-кВ (NF-кВ), 6-амино-4- (4а-феноксифенилетиламино) хиназолин (QNZ), е закупен от Calbiochem. Liberase blendzyme 3 е от Roche. Инсулин, дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин (IBMX), водороден пероксид, N-ацетил-1-цистеин (NAC), ксантиноксидаза, хипоксантин, глюкоза оксидаза и BSA са получени от Sigma (Сейнт Луис, Мисури).

Клетъчна култура и изолиране на първични адипоцити.

3T3-L1 клетки са получени от American Type Culture Collection (Rockville, MD). Клетките се поддържат в модифицирана с 10% FBS среда на Dulbecco's Eagle's среда (DMEM) с пеницилин и стрептомицин в 5% CO2 инкубатор при 37 ° C. Два дни след сливането клетките се диференцират чрез инкубиране в диференцираща среда, съдържаща 0,5 mmol/l IBMX, 0,2 μmol/l дексаметазон и 10 μg/ml инсулин. Три дни след добавянето на този диференциращ коктейл, клетките бяха поставени в DMEM, съдържащ 10 μg/ml инсулин и 10% FBS. Всички експерименти бяха проведени 10 дни след диференциацията.

Количество на ApoE иРНК.

Обща РНК беше изолирана от мастна тъкан, плаващи адипоцити, стромоваскуларни клетки или 3T3-L1 адипоцити, използвайки RNeasy мини комплект (Qiagen, Валенсия, Калифорния). КДНК от първа верига е синтезирана от 1 μg обща РНК с помощта на Thermoscript RT-PCR система (Invitrogen) в съответствие с инструкциите на производителя. PCR в реално време се извършва на всяка проба, използвайки количествената PCR система Mx3000p (Stratagene, La Jolla, CA), използвайки iTaq SYBR Green Supermix с ROX. Относителното количество на апоЕ иРНК се изчислява след корекция за изобилието на β-актин иРНК и се изразява за всеки експеримент като кратна промяна в сравнение с експерименталния контрол (20). Двойките праймери, използвани за амплифициране на апоЕ и β-актин гени, са 5′-AGGATCTACGCAACCGACTC-3 ′, 5′-GGCGATGCATGTTCCACTA-3 ′ и 5′-GGCCCAGAGCAAGAGAGGTA-3 ′, 5′-GGACTCATCGTACC ′ 3CGTACCTGCACTGCACTGCACTGCACTTGCACTGCACTTGCACTGCACTGCACTTGCACTGCACTTGCACTGCACTTGCACTGCACTGTACCTG. Чистотата на реакционния продукт се потвърждава чрез изследване на кривите на топене за отделен пик.

Уестърн блотинг.

Общият протеин се екстрахира от клетки или тъкан с помощта на радиоимунопреципитационен буфер за анализ (0,5% натриев дезоксихолат, 0,1% SDS, 1% Triton X, 20 mmol/l Trisma основа, 150 mmol/l NaCl и 5 mmol/l EDTA), допълнен с коктейл с протеазен инхибитор. Пробите се центрофугират в продължение на 5 минути, горният мастен слой се изхвърля и се събира средният бистър слой от солюбилизиран протеин. Общата концентрация на протеин беше анализирана с помощта на Bio-Rad DC протеинов анализ. Петдесет микрограма протеин за всяка проба се подлагат на SDS-PAGE анализ, прехвърлят се в нитроцелулоза и се сондират с антитела за апоЕ, IκBα фосфорилиран IκBα или β-актин. Western blot изображенията се определят количествено, като се използва софтуер ImageQuant TL (GE Healthcare, Piscataway, NJ), като се използва β-актин като вътрешен контрол на натоварването.

Участие на NF-κB пътеката.

Активирането на NF-κB пътя беше първо оценено чрез откриване на нивото на IκBα фосфорилиране. След третиране на 3T3-L1 адипоцити с 1 mmol/l H2O2 за 0, 1, 5 или 10 минути, клетките се лизират в присъствието на фосфатазен инхибиторен коктейл. Петдесет микрограма от общия клетъчен екстракт се подлагат на Western blot анализ, като се използва антитяло, специфично за IκBα, фосфорилирано при серин 32/36. Петната се отстраняват и повторно се изследват с антитяло до общия протеин IκBα. Участието на NF-кВ пътя също е оценено чрез добавяне на QNZ (инхибитор на активиране на NF-кВ комплекс) към клетките в присъствието или отсъствието на 1 mmol/l H2O2.

Измерване на клетъчен H2O2.

Клетъчната ROS се измерва, като се използва флуоресцентно багрило 5 (-и-6) -хлорометил-2′7′-дихлорохидрофлоресцеин деацетат ацетил естер (CM-H2DCFDA; Молекулярни сонди), както е описано по-рано с малки модификации (24). След третиране с глюкозна оксидаза или ксантиноксидаза, диференцираните адипоцити се промиват с DMEM без фенол и се инкубират с 2 μmol/l CM-H2DCFDA в продължение на 45 минути при 37 °. Флуоресценцията беше анализирана с помощта на BIOTEK Synergy H флуоресцентен четец за плаки при дължина на вълната на възбуждане 485 nm и емисия при 530 nm. Клетъчната ROS концентрация се изчислява, като се използва стандартна крива H2O2.

Статистически анализ.

Статистическите разлики между експериментални групи бяха оценени с помощта на t-тест на две проби на Student. Стойности на P 70% (фиг. 4В).

Затлъстяването води до повишено производство на ROS в мастната тъкан и по-рано сме показали, че експресията на мастна тъкан и зряла адипоцитна апоЕ са намалени при затлъстели мишки в сравнение с постни мишки. Следователно, следващата оценка на потенциалната роля на ROS допринася за намалената експресия на мастната тъкан и апоЕ на адипоцитите при затлъстяване. Подходихме към този въпрос, като сравнихме въздействието на лечението на прясно изолирана мастна тъкан или зрели адипоцити от затлъстели и слаби мишки с антиоксиданта NAC (фиг. 5). Както по-рано съобщавахме, експресията на апоЕ е по-ниска в мастната тъкан и адипоцитите, изолирани от ob/ob мишки, в сравнение с постните контроли за отпадъци (23). Лечението на мастна тъкан или адипоцити, изолирани от постни мишки с NAC, не повлиява значително нивото на експресия на апоЕ. Въпреки това, лечението на мастна тъкан или зрели адипоцити, изолирани от затлъстели мишки с NAC, повишава нивото на тРНК на мастната тъкан съответно с пет и четири пъти. Тези резултати показват, че оксидативният стрес на мастната тъкан е важен фактор, допринасящ за потискането на мастната тъкан и апоЕ на адипоцитите при затлъстяване.

Затлъстяването се характеризира с приток на възпалителни клетки в стромоваскуларното отделение на мастната тъкан. Сигнализирането между възпалителните клетки в стромоваскуларния отдел и адипоцитите е идентифицирано като важен фактор за дисфункцията на адипоцитите при затлъстяване (5-7,30). След това разгледахме въпроса дали стромоваскуларната фракция на мастната тъкан от затлъстели мишки може да модулира експресията на апоЕ в адипоцити, получени от постни мишки (фиг. 6А). Прясно изолирани зрели адипоцити от постни мишки се инкубират самостоятелно или със стромоваскуларната клетъчна фракция от постни мишки или от затлъстели мишки. След 4 часа инкубация, нивата на апоЕ тРНК бяха потиснати в адипоцитите, инкубирани със стромоваскуларната клетъчна фракция от затлъстели мишки с> 80%. След това оценихме дали потискащият ефект на стромоваскуларната фракция е различен за стромоваскуларните фракции, изолирани от висцерално или подкожно мастно депо на затлъстели мишки (фиг. 6В). Добавянето на затлъстела стромоваскуларна фракция от депото на мазнини значително потиска нивото на апоР мРНК на адипоцитите, но потискането, произведено от висцералната стромоваскуларна фракция, е значително по-голямо от това, произведено от подкожната стромоваскуларна фракция.

Горните наблюдения показват, че ендогенната експресия на апоЕ е важна за придобиването на адипоцити на триглицериди от богати на извънклетъчни триглицериди липопротеини (TGRL). По този начин нивото на експресия на апоЕ в адипоцитите може да повлияе на разпределянето на липидите в циркулиращите TGRL между адипоцитите и други тъкани. Например, намаленото отлагане на липиди на TGRL в мастната тъкан в резултат на намалена експресия на апоЕ на адипоцити (като това, наблюдавано при затлъстяване) може да благоприятства доставянето на липиди в черния дроб и мускулите, където отлагането на този липид е замесено в производството на тъканно специфична инсулинова резистентност (32 –35). По-рано показахме, че липогенният отговор на агонистите на PPARy е дефектен в апоЕ -/- адипоцитите, дори когато се инкубира в присъствието на апоЕ-съдържащ серум. Следователно, повишената експресия на апоЕ на адипоцити може също така да участва в разширяването на мастната тъкан, което се наблюдава при прилагане на PPARy агонисти (36–38). Тези въпроси ще изискват допълнително проучване.

Горните съображения подчертават важността на интегрирането на адипоцитния апоЕ в общ модел на метаболизма на адипоцитните липиди. Както беше отбелязано по-горе, системното приложение или лечение на изолирани клетки с PPARγ агонисти увеличава експресията на апоЕ на адипоцитите (21). Обратно, лечението с провоспалителния пептид ангиотензин II намалява адипоцитния апоЕ (22). Индуцираното от диетата или липсата на лептин затлъстяване води до намалена експресия на апоЕ и по-рано демонстрирахме, че TNF-α намалява експресията на апоЕ на адипоцитите (21,23). Наблюденията в настоящия ръкопис показват, че ROS и оксидантният стрес, налични при затлъстяването, са важен път за потискане на експресията на апоЕ на адипоцитите. Този път има голямо патофизиологично значение предвид появяващите се доказателства, че оксидативният стрес в мастната тъкан се увеличава както при затлъстяването, така и при диабета (9,28), като две заболявания стават все по-разпространени в световен мащаб.

Нашите наблюдения също така предоставят доказателства за важно взаимодействие между адипоцитите и стромаскуларните клетки на мастната тъкан за индуциране на оксидативен стрес с намалена експресия на апоЕ в адипоцитите. Това прооксидантно и възпалително взаимодействие предполага, че интервенциите, които намаляват възпалението на мастната тъкан и оксидантния стрес, ще увеличат експресията на апоЕ на адипоцитите. PPARγ агонистите потискат проинфламаторния фенотип в макрофагите и предизвикват апоптоза на макрофагите на мастната тъкан (39). В допълнение е демонстриран специфичен противовъзпалителен ефект на PPARγ агонистите в мастната тъкан (40,41). Следователно PPARγ агонистите биха могли да увеличат апоЕ на адипоцитите както чрез директен ефект върху гена на аподицитния апоЕ (21), така и чрез потискане на възпалението на мастната тъкан.