Катедра по хирургия, Държавен университет в Ню Йорк, Център за здравни науки в Бруклин, Бруклин, Ню Йорк 11203; и

Катедра по хирургия, Държавен университет в Ню Йорк, Център за здравни науки в Бруклин, Бруклин, Ню Йорк 11203; и

Департамент по хранителни науки, Университет Рутгерс, Ню Брънзуик, Ню Джърси 08901

Катедра по хирургия, Държавен университет в Ню Йорк, Център за здравни науки в Бруклин, Бруклин, Ню Йорк 11203; и

Резюме

значителни доказателства показват неблагоприятните ефекти върху здравето на централното разпределение на мастната тъкан с превес на интраабдоминално или висцерално натрупване на мазнини. Факторите, причиняващи такова разпределение и патогенетичните механизми не са известни, но се смята, че излишъкът от висцерални мазнини играе ключова роля в етиологията на метаболитния „синдром X“ на затлъстяването (17).

Този експеримент изследва ролята на подкожната мастна тъкан (SQAT) в метаболитния синдром на затлъстяването чрез хирургично създаване на относителен „дефицит“ на SQAT. Предлага се аналогия с различни липодистрофии, демонстриращи метаболитни аномалии като инсулинова резистентност (45) и дислипидемия (22,34), смятани за „парадоксално“ подобни на аномалии, открити при затлъстяване или излишък на мастна тъкан.

По-рано отбелязахме, че някои от нашите пациенти, подложени на екстензивно хирургично намаляване на SQAT следоперативно, са имали повишени нива на серумен инсулин и триглицериди (21). Други пациенти от нашия опит, които са имали преди това липектомия, впоследствие развиват тежко или „болезнено“ затлъстяване с неинсулинозависим диабет и дислипидемия (19), което предполага вреден ефект от отстраняването на подкожната мастна тъкан. Всъщност се предполага, че мазнината на бедрото може да бъде „защитна“ срещу аномалии на липопротеините, свързани със сърдечно-съдови заболявания (48), и едно проучване върху животни показва дисфункция на липопротеиновата липаза на мастната тъкан като определящ фактор за хипертриглицеридемия (15).

Тук ние разширяваме предишната си работа с животни, използвайки изрязване на мастната тъкан, адипектомия (10, 18), за да намалим количеството на SQAT в животински модел на диетично затлъстяване, за да проверим хипотезата, че дефицитът на SQAT причинява метаболитни аномалии. Също така изследвахме въздействието на подкожната липектомия върху серумния лептин, произведен от мастната тъкан ob протеин.

Животни, аклиматизация и боравене

Двадесет и осем възрастни (125–135 g) женски сирийски хамстери (Harlan Sprague Dawley) бяха настанени в отделни клетки от плексиглас с постелки от кедрови чипове. Условията в стаята бяха контролирани за температура (75 ° F), влажност (40%) и 16: 8-часов цикъл светлина-тъмнина. Животните са обработвани ежедневно по време на ежедневно измерване с чешмяна вода, като условие за бъдещи орални тестове за толерантност към глюкоза (OGTT) и усвояване на [14 C] олеинова киселина. Животните се претеглят двуседмично и се аклиматизират за настаняване и обработка в продължение на 2 седмици предоперативно.

Диети

Животните са имали свободен достъп до чешмяна вода и изокалорични диети с високо съдържание на мазнини (HF) или ниско съдържание на мазнини (LF), които отговарят на изискванията за протеини, минерали и витамини (Research Diets, New Brunswick, NJ). HF диетата съдържа 50 калории% мазнини, 27,5% въглехидрати и 22,5% протеини. Диетата LF съдържа 12,5 калории% мазнини, 65% въглехидрати и 22,5% протеини. Източниците на мазнини са половината от соевите и хидрогенираните кокосови масла.

Групи

Животните бяха разпределени на случаен принцип в една от трите групи: липектомия на HF диета (L-HF, н = 9), фиктивна липектомия на високочестотна диета (S-HF, н = 9), или фиктивна липектомия на LF диета (S-LF, н = 9).

Процедури

Хирургически.

След гладуване в продължение на 16 часа със свободен достъп до вода, животните се анестезират интраперитонеално със 100 mg/kg кетамин плюс 10 mg/kg ксилазин. Коремът беше обръснат и изтрит с Betadine. Направен е 3-см напречен разрез през ингвиналната област. Превъзходният кожен клап беше разрязан до нивото на ребрената дъга; долният клапан е разрязан около перинеума от вътрешната страна на бедрата до коленете. И двата капака бяха удължени заднолатерално до гръбначния стълб („колан липектомия“). След това подкожната мастна подложка беше рязко дисектирана от фасцията, изрязана и претеглена. Нямаше видими доказателства за наличие на кафява мастна тъкан в хирургичния образец. Тази процедура премахва повече от 50% от цялата подкожна дисектируема мастна тъкан при 130 g женски хамстери, съответстваща на ∼15–20% от цялата мастна тъкан.

Разрезът беше затворен с прекъснати 3-0 найлонови шевове. Животните бяха върнати в клетките си след възстановяване от упойка. Фиктивните процедури са идентични с липектомията с повдигане на клапи, но без изрязване на мастните накладки. Всички животни са били проследявани ежедневно в продължение на 2 седмици за проследяване на следоперативното зарастване на рани и наддаване на тегло.

OGTT на гладно.

След 11 седмици, 1 седмица преди смъртта, всички животни са подложени на OGTT. След 16-часов пост със свободен достъп до вода, 1,5 g/kg телесно тегло декстроза се смесва в 0,5 ml стерилна вода и се дава чрез сонда. Взети са кръвни проби (0,5–0,75 ml) от ретро-орбиталния синус под седация на CO2, на изходно ниво, след 30 минути и след 120 минути за определяне на серумна глюкоза и серумен инсулин.

Поглъщане на олеинова киселина на гладно [14 C].

Всички животни са били дадени с 0,9 ml сусамово масло, съдържащо 1 μCi [14 C] олеинова киселина (Dupont NEN Products, Бостън, Масачузетс) 16 часа преди да бъдат убити. Този интервал от време е избран въз основа на данните на Li et al. (25) при плъхове, демонстриращи максимално усвояване в мастната тъкан след 16 часа.

Смърт

На 12 седмици, без гладуване, по обяд животните бяха седатирани с CO2 и 4–6 ml кръв бяха събрани от ретро-орбиталния синус в нехепаринизирани епруветки за допълнителни серумни анализи. След това животните бяха убити чрез обезкървяване.

Труповете бяха инспектирани за повторно израстване на местата на липектомия. Подкожните (SQ), параметриалните (PM) и периреналните (PR) мастни накладки се дисектират, изрязват, претеглят и съхраняват при -20 o C, докато не бъдат анализирани.

Черният дроб беше отстранен и претеглен след изхвърляне на жлъчния мехур. Части от черния дроб се съхраняват при -20 o C за екстракция на протеини и липиди и анализ на 14 C. Една аликвотна част се съхранява в течен азот за определяне на глутатион като маркер за липидна пероксидация (41). Малка проба беше фиксирана във Формалин за хистологично изследване.

Стомашно-чревният тракт от хранопровода до ректума е отстранен. Останалата трупна маса се хомогенизира във вода и аликвотни части се анализират за липиди гравиметрично след липидна екстракция с помощта на разтвор на Dole. Измерва се сухото тегло на трупа, докато се изчислява сухото тегло без съдържание на мазнини и съдържанието на вода.

Химически анализи

Кръв.

Серумът се съхранява при -20 o C до спектрофотометрично определяне на аланин аминотранспептидаза, алкална фосфатаза и триглицериди (Sigma, St. Louis, MO). За определяне на лептин се използва комплект за радиоимуноанализ (RIA). Пробите, събрани по време на OGTT, се измерват за нива на глюкоза с помощта на анализатор на глюкоза Beckman 2. Инсулинът се определя, като се използва 125 I-RIA със стандарт за инсулин на плъхове (IncStar, Stillwater, MN).

Черен дроб.

Определянето на чернодробния протеин се извършва спектрофотометрично от хомогенизирани мокри тъканни проби (Sigma, модифициран метод на Lowry). Екстракцията на липиди се извършва съгласно Folch и се измерва гравиметрично. Чернодробният глутатион, чувствителен маркер на хепатоцелуларно увреждане, се определя с метода, описан от Salazar et al. (41).

Хистологичното оцветяване на хематоксилин и еозин в чернодробната тъкан се приготвя в съответствие с процедурите на Катедрата по патология. Пробите са изследвани от патолога без знание на експерименталните групи и са класифицирани в полуколичествена скала за количество липиди в хепатоцитите.

Мастна тъкан.

Пробите от депата за PR мазнини се поставят в 0.9% NaCl. Те бяха попити и претеглени и използвани за екстракция на Folch и фиксиране на осмий за оразмеряване на клетките и изчисляване на броя на клетките (14). Това депо е избрано за оразмеряване на мастните клетки, тъй като е доказано, че е най-чувствително към манипулации с телесни мазнини (напр. Реф. 23). [14 С] броят на олеиновата киселина в мастните и чернодробните тъкани се определя преди липидна екстракция с помощта на течен сцинтилационен спектрометър Packard Tricarb.

Статистика

За изчисляване са използвани програмите SPSS и Statview II и Microsoft Excel 97 т-тестове, ANOVA и Scheffé post hoc тестове според случая. Всички резултати са представени като средни стойности ± SE. Корелациите на Пиърсън бяха изчислени за избрани непрекъснати променливи.

Протоколът е одобрен от Институционалната комисия за грижи и употреба на животните в съответствие с насоките на Асоциацията за акредитация и оценка на лабораторните грижи за животните.

Общ

HF диетата доведе до еднакви телесни тегла в двете групи HF, които бяха по-високи, отколкото при S-LF животни (Таблица1; Фиг. 1;P

Таблица 1. Телесно тегло, тегло на мастната тъкан и съдържание на липиди в трупа в липектомизирани или фалшиви женски сирийски хамстери след 12 седмици при HF или LF диети

Стойностите са средни стойности ± SE; n = 9 хамстера/група. СН, диета с високо съдържание на мазнини; LF, диета с ниско съдържание на мазнини; SQAT, подкожна мастна тъкан; PR, perirenal; PM, параметричен; IA, интраабдоминално (PR + PM); L-HF, липектомизирана HF група, S-HF и S-LF, фалшиви HF и LF групи.

F1-a P F1-b P F1-c P F1-d P = 0,10 за S-HF срещу L-HF или S-LF;

F1-e P F1-f P

метаболитен

Фиг. 1.Тежести в липектомизирани (L) и фалшиви (S) възрастни женски хамстери на високомаслени (HF) или контролни, нискомаслени (LF) диети, следвани в продължение на 12 седмици.

Складове за мастна тъкан

Влажните тегла на мазнините (SQ, PM, PR) са значително по-големи в групите с висока честота, отколкото в групата с S-LF (P

Таблица 2. Чернодробна тъкан при липектомизирани или фалшифицирани женски сирийски хамстери на HF или LF диети

Стойностите са средни стойности ± SE; n = 9 хамстера/група.

* P = 0,07 L-HF срещу S-LF.

Таблица 3. Тестове за кръвна химия и орален глюкозен толеранс при женски сирийски хамстери

Стойностите са средни стойности ± SE; n = 9 хамстера/група. ALAT, аланин аминотранспептидаза; AP, алкална фосфатаза.

F3-a P F3-b P F3-c P F3-d P = 0,10 за S-HF срещу L-HF или S-LF;

F3-e P F3-g P 14 C] усвояването на олеинова киселина в мастната тъкан е значително по-голямо в групата S-LF, отколкото във всяка група HF, без разлика между липектомирани и фалшиво оперирани животни (Таблица 4). При S-LF поглъщането на животни в интраабдоминалните депа (PM и PR) е по-голямо, отколкото в SQAT [PM, 17,0 ± 2,8 броя/мин (cpm) × 10 -3/g; PR, 14,0 ± 2,3 cpm × 10-3/g; SQ, 8,4 ± 1,7 cpm × 10-3/g; P 14 C] усвояване на олеинова киселина (r = -0,61; P 14 C] олеинова киселина също е била по-голяма в S-LF групата, отколкото в двете HF групи (P = 0,004; Таблица 4).

Таблица 4. [14 C] поемане на олеат в SQ, PM и PR мастна тъкан и черен дроб при женски сирийски хамстери

Стойностите са средни стойности ± SE; n = 9 хамстера/група. cpm, брои/мин.

F4-a P F4-b P F4-c P F4-d P F4-e P

Фиг. 2.Връзка между теглото на мастните клетки и измерването на [14 C] олеат в периреналната мастна тъкан. FCW, тегло на мастните клетки.

Има обратни връзки между поемането на черния дроб и сумите на инсулина (r = -0,39; P

Фиг. 3.Инсулинова сума по време на орални тестове за толерантност към глюкоза и [14 C] поемане на олеат в чернодробната тъкан.

Анализ на лептин