• Намерете този автор в Google Scholar
  • Намерете този автор в PubMed
  • Потърсете този автор на този сайт
  • За кореспонденция: [email protected]

Редактирано от Джоузеф М. ДеСимон, Университет на Северна Каролина в Chapel Hill and Carbon, Chapel Hill, NC, и одобрено на 19 август 2016 г. (получено за преглед на 22 ноември 2015 г.)

като средни стойности

Значимост

Резистентността към химиотерапии на базата на платина и паклитаксел е често срещана при рецидиви както на висококачествен рак на яйчниците, така и на ендометриума. Резистентността към паклитаксел е свързана с свръхекспресия на бета-тубулин от клас III, преференциалната цел на епотилоните, стабилизиращи микротубули агенти. Епотилон В (ЕВ) е многократно по-ефективен от паклитаксел, но клиничната употреба е ограничена от странични ефекти. За да намалим страничните ефекти, ние капсулирахме EB в биоадхезивни наночастици (BNP), като разсъждавахме, че биоадхезивните наночастици, заредени с епотилон B (EB/BNP), ще взаимодействат с коремните тъкани и постепенно освобождават EB в близост до импланти на перитонеален рак, като по този начин поддържат концентрацията на EB място на действие и ограничаване на системната експозиция и токсичност. Нашите експерименти показват по-висока терапевтична активност и ограничена токсичност на EB/BNPs в сравнение с неадхезивни наночастици, заредени с EB или без носител EB.

Резюме

I.p. прилагането на химиотерапия при пациенти с серозен карцином на яйчниците и матката чрез биоразградими наночастици може да представлява високо ефективен начин за потискане на перитонеалната карциноматоза. Въпреки това, ефикасността на наночастиците, заредени с химиотерапевтични агенти, в момента е затруднена от бързото им изчистване чрез лимфен дренаж. Тук показваме, че уникална формулировка на биоадхезивни наночастици (BNP) може да взаимодейства с мезотелиалните клетки в коремната кухина и значително да удължи задържането на наночастиците в перитонеалното пространство. BNP, заредени с мощен химиотерапевтичен агент [епотилон В (EB)], показват значително по-ниска системна токсичност и по-висока терапевтична ефикасност срещу i.p. устойчиви на химиотерапия ксенографти, получени от маточен серозен карцином, в сравнение със свободен EB и не-BNP, заредени с EB.

Висококачественият серозен карцином на яйчниците и матката (USC) са биологично агресивни тумори, които обикновено се разпространяват в перитонеалната кухина, разпространявайки се по коремната и тазовата перитонеума и водят до перитонеални метастази. Въпреки че тези тумори често реагират на първоначална циторедуктивна хирургия и химиотерапия с платина-паклитаксел, повечето пациенти развиват рецидиви и в крайна сметка умират от прогресия на устойчиво на химиотерапия заболяване (1).

Разградимите полимерни наночастици имат няколко потенциални предимства пред микрочастиците и хидрогеловете в терапията на рака (12 ⇓ ⇓ ⇓ –16). Наночастиците (∼100 nm) са малки в сравнение с микрочастиците (∼10–100 µm) и следователно трябва да се разпределят по-равномерно в перитонеума. Освен това, наночастиците са достатъчно малки, за да бъдат интернализирани от туморни клетки (17, 18), което им позволява да освобождават капсулираните лекарства близо до биологичната цел, която често е в клетъчното ядро. Въпреки че много изследвания показват, че наночастиците са обещаващи носители за доставяне на химиотерапевтични агенти в предклинични in vivo модели, приложението на наночастици за i.p. доставката остава затруднена от бързото им изчистване от перитонеалната кухина, главно в резултат на лимфен дренаж (19).

Схема, показваща преобразуването на BNP от NNP и съдбата на NNP и BNP след i.p. доставка. BNP могат да бъдат преобразувани от NNP чрез обработка с NaIO4. След i.p. доставка, (вляво) NNP се изчистват чрез лимфен дренаж, но (вдясно) BNP се задържат в перитонеалната кухина поради тяхното биоадхезивно свойство.

Резултати

TEM изображения на (A) DiD/NNP, (B) DiD/BNP и (C) DiD/NNP-R (DiD/NNP, намалени от DiD/BNPs чрез обработка с NaBH4). (Мащабни ленти: 200 nm.) (D) Концентрацията на алдехиди върху BNPs като функция от времето на инкубация с NaBH4. (E) Задържане на BNP върху покрити с (поли-лизин) плочи в сравнение с NNP и NNP-R. * P Вижте тази таблица:

  • Преглед на линия
  • Преглед на изскачащия прозорец

Измервания на размера на наночастиците

Илюстрация на BNP, NNP-R и NNP. (А) Превръщането на BNPs в NNP-Rs чрез третиране с NaBH4. (B) Повърхностната структура на NNP.

(A) In vitro задържане на IR-780 йодидно багрило в NNPs, използвайки буфер, симулиращ i.p. течност над 10 d. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 3). (B) Задържането на (Ляв) IR-780 йодид/NNP и (Вдясно) IR-780 йодид/BNP, наблюдаван чрез изображения на живо 10 d след i.p. доставка.

TEM изображения на (A) IR-780/NNP и (B) IR-780/BNP. (Мащабна лента: 200 nm.)

Разпределение на BNP в перитонеалната кухина, визуализирано чрез IR флуоресцентно изобразяване. (A) Изображения на живо на (вляво) контролна неинжектирана мишка и (вдясно) на мишка 18 часа след инжектиране на 1 mg IR-780/BNP. IR флуоресцентно изобразяване на (вляво) контролна мишка и (вдясно) мишка, инжектирана с IR-780 йодидни BNP (B) преди и (C) след отстраняване на всички органи в перитонеалната кухина.

Характеризиране на EB/BNP. TEM изображения на (A) EB/BNP и (B) EB/NNP. (Мащабни ленти: 200 nm.) (C) EB се освобождава от EB/BNP и EB/NNP за период от 24 часа инкубация в PBS. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 4). (D) Жизнеспособност на USC клетки след инкубация със свободни EB, EB/NNPs и EB/BNPs в продължение на 3 дни. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 8). (E) Жизнеспособност на USC клетки след инкубация с празни BNPs и NNPs в продължение на 3 дни. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 8). (F) EB задържане в перитонеалната кухина след i.p. администриране на безплатни EB, EB/NNP и EB/BNP. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 3).

Ефектът на празните BNP върху множество клетъчни линии. (А) Жизнеспособност на HeLa и ендотелни клетки от човешка пъпна вена (HUVEC) след инкубация с празни BNP и NNP за 3 дни. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 8). (Б) Жизнеспособност на множество клетъчни линии след инкубация с празни BNP и NNP за 3 дни. Данните са показани като средни стойности ± SD (n = 8).

Нашата хипотеза е, че EB/BNPs могат да защитят перитонеума срещу прикрепването на плаващи ракови клетки в перитонеалната течност; тази защита се осигурява от задържане на BNP върху богати на протеини перитонеални повърхности и способността им да доставят EB локално за лечение на прилепнали клетки (фиг. 1). За да се симулира микросредата, в която очакваме наночастиците да пребивават след i.p. инжекция, ние оценихме in vitro ефикасността на повърхностно имобилизирани EB/BNP, за да потиснем растежа на USC клетки. Тук използвахме микроскопски диапозитиви, покрити с поли (1-лизин) и ги инкубирахме със свободен ЕВ, ненатоварени наночастици или натоварени с ЕВ наночастици (Фиг. 5А). Наблюдавахме значително потискане на растежа на туморни клетки само в слайд зони, предварително обработени с EB/BNP (Фиг. 5 B и C). Не се наблюдава потискане на туморния растеж на повърхности, третирани с празни BNP или EB/NNP. Въпреки че това е in vitro модел система и липсва много от характеристиките на i.p. тези резултати предполагат, че BNPs се задържат върху покритата с лизин повърхност на предметните стъкла поради техните биоадхезивни свойства и са в състояние да доставят EB локално до съседните клетки по-ефективно от всеки друг препарат от наночастици.

Терапевтична ефикасност на EB/BNP върху мишки, носещи i.p. USC тумори. (A) Криви на преживяемост по Каплан-Майер за лечение на EB при 2,5 mg/kg. (Б) Като мярка за токсичност, мишките, третирани като в А, се претеглят два пъти седмично. (C) Криви на преживяемост по Каплан-Майер за лечение на EB при 0,5 mg/kg. (D) Мишките, третирани като в С, се претеглят два пъти седмично. В А и С оста x показва броя на дните от първата доза лекарство. В B и D средното тегло се показва като функция от дните от първата доза на лекарството. Извършен е статистически анализ, както е описано в SI Методи.

Дискусия

Когато не са заредени с лекарства, BNP не са токсични. В клетъчните култури BNP не показват никаква цитотоксичност, дори при висока концентрация (т.е. до 1 mg/ml), а мишките, лекувани с BNP (ip инжекция от 5 mg BNP веднъж седмично в продължение на 5 седмици), нямат доказателства за тегло загуба или поведенчески промени. Освен това повтарящият се i.p. инжектирането на BNPs не изглежда да води до някакви неспецифични отговори, които да повлияят на растежа на тумора или здравето на животните (фиг. 6). Ниската токсичност на BNPs се дължи на няколко фактора. (i) Въпреки че свободните нискомолекулни алдехиди могат да бъдат токсични (32), повърхностните алдехидни групи са ковалентно свързани към BNPs, ограничавайки тяхната дисперсия. (ii) Очаква се висока толерантност към алдехидите, тъй като те присъстват широко в храни, аромати и метаболити и могат да бъдат ефективно детоксикирани от ензима алдехид дехидрогеназа (33).

Важно е, че при мишките, третирани с EB/BNPs, ние показахме значително подобрена преживяемост в сравнение с контрола (P1-лизин), покритият предмет беше разделен на пет блока с писалка (Abcam). Всеки блок беше добавен индивидуално със 100 µL EB/BNP (1 mg наночастици на 1 ml и 0,025 mg EB на 1 ml), EB/NNP (1 mg наночастици на 1 ml и 0,025 mg EB на 1 ml), EB (0,025 mg/mL), празни BNP (1 mg/mL) и PBS. След 30 минути инкубация при стайна температура, всяко стъкло се измива обилно с много PBS и се поставя в 10-сантиметрова чиния, пълна с 20 ml среда, съдържаща USC клетки с плътност 2,0 × 10 5/ml. След инкубация при 37 ° С за 24 часа, средата се аспирира и предметните стъкла се измиват с 20 ml PBS четири пъти. Клетките се оцветяват с Hoechst (за ядра; синьо) и живо/мъртво оцветяване (зелено за живи клетки и червено за мъртви клетки; Thermo Fisher Scientific) и след това се изобразяват чрез флуоресцентна микроскопия. Броят на клетките се отчита чрез ядра с анализ на частици ImageJ. Жизнеспособността се определя чрез нормализиране на клетъчната плътност до контрола, считан за 100% жизнеспособен.

Кръвообръщение.

Всички грижи и проучвания за животните са одобрени от институционалния комитет по грижа и употреба на животните в Йейлския университет. Всички наночастици бяха заредени с 0,2% DiD. Девет мишки C57BL/6 (n = 7 на група) получиха инжекция в опашната вена от 150 µL натоварени с DiD наночастици (3 mg/ml в разтвор на PBS). На 5 минути, 15 минути, 30 минути, 1 час, 2 часа, 4 часа, 8 часа, 24 часа, 48 часа и 72 часа се събира 10-20 µL кръв от всяка мишка чрез изрязване на опашката. Кръвта беше лиофилизирана. За количествено определяне на флуоресценцията в кръвта се добавят 100 μL DMSO и 1 ml ацетонитрил и се хомогенизират с хомогенизатор. Хомогенизираният разтвор се върти на еталонна центрофуга при 15 680 х g и след това 0,8 ml супернатант се отстранява и се добавя в епруветка на Eppendorf. Целият ацетонитрил се изпарява със SpeedVac и багрилото в DMSO се измерва количествено чрез измерване на флуоресценция при 670 nm с дължина на вълната на възбуждане при 644 nm с четец на плочи.

Профил на задържане на EB в перитонеалната кухина.

Мишките C57BL/6 (на възраст 5–6 седмици; лабораториите на Charles River) бяха разделени на три групи с по девет мишки на група и една група с три мишки. Групата с три мишки беше използвана като средство за контрол на носителя. Безплатен EB [5 mg/ml основен разтвор в 30% (тегло/тегло) PEG 400, 0,5% Tween80, 5% (тегло/тегло) пропилей гликол, 64,5% (тегло/тегло) вода, разредена до необходимата концентрация с PBS преди употреба ], EB/NNP или EB/BNP при ефективна доза EB от 2,5 mg/kg бяха ip инжектирани в мишки във всяка от трите групи. Във всяка времева точка (6 h, 1 d и 3 d), три мишки от всяка група и една мишка от групата с три животни бяха евтаназирани и перитонеалните кухини бяха промити с 5 ml ацетонитрил три пъти. Ацетонитрилните проби се центрофугират при 9 300 х g за 10 минути и супернатантата се събира. Ацетонитрилът се изпарява и остатъкът се разтваря в 0,5 ml ЕА. След завихряне и центрофугиране при 9 300 х g за 10 минути, супернатантата на ЕА се събира в епруветка на Епендорф и ЕА се изпарява. Към всяка изпарена проба се добавя метанол (0,3 ml) и всяка проба се завихря. След центрофугиране при 9 300 х g за 10 минути, супернатантата на метанола се събира. Концентрацията на ЕВ се определя с HPLC с колона С18 с метанол: вода (7: 3) с UV детектор, настроен на 240 nm абсорбция.

Терапевтични проучвания.

Голи мишки BALB/c (на възраст 5–6 седмици; лаборатории Чарлз Ривър) бяха i.p. инжектирани с 1 × 106 USC клетки. След 1 седмица започнаха медикаментозно лечение с осем животни във всяка група. В един експеримент бяха сравнени три групи: (i) PBS (400 µL), (ii) свободен EB разтвор [5 mg/ml основен разтвор в 30% (wt/wt) PEG 400, 0.5% Tween80, 5% (wt/тегло) пропилей гликол, 64,5% (тегло/тегло) вода, разредена до необходимата концентрация с PBS преди употреба; 400 µL) и (iii) EB/BNPs, суспендирани в PBS (400 µL). В този експеримент леченията се прилагат i.p. с доза от 2,5 mg/kg EB всяка седмица в продължение на 3 седмици. В друг експеримент бяха сравнени пет групи: (i) PBS (400 µL), (ii) празни BNPs, суспендирани в PBS (400 µL), (iii) свободен EB разтвор (5 mg/ml основен разтвор в 30% (тегло/wt) PEG 400, 0.5% Tween80, 5% (wt/wt) пропилей гликол, 64.5% (wt/wt) вода, разредена до необходимата концентрация с PBS преди употреба; 400 µL], (iv) EB/NNPs, суспендирани в PBS ( (400 µL) и (v) EB/BNPs, суспендирани в PBS (400 µL). В този експеримент лечението се прилага ip с доза от 0,5 mg/kg EB всяка седмица в продължение на 5 седмици.

Теглото на тялото на мишките се измерва два пъти седмично. Животните бяха евтаназирани, когато загубата на телесно тегло надхвърли 20% или когато се наблюдават други сигнали за заболяване, като проблеми с дишането, липса на храна и напитки, летаргия, сериозна обструкция на червата или ненормална стойка. Оцеляването на животните се анализира чрез анализ на Kaplan – Meier. Статистическият анализ беше направен чрез log rank test с помощта на инструменти в GraphPad/Prism 6.

Благодарности

Благодарим на Yukun Pan, Tian Xu, Yu Wu, Yao Lu и Rong Fan от Йейлския университет за достъп до инструменти в техните лаборатории. Тази работа беше подкрепена от NIH Grants CA149128 и CA154460.

Бележки под линия

  • ↵ 1 До кого трябва да се адресира кореспонденция. Имейл: mark.saltzmanyale.edu .