Фотобактериоза: Профилактика и диагностика

1 Катедра по биомолекулярни науки, Секция по биотехнологии, Университет в Урбино „Карло Бо“, Via Arco d’Augusto 2, 61032 Фано, Италия

Резюме

Фотобактериозата или рибната пастерелоза е бактериално заболяване, засягащо дивите и селскостопанските риби. Неговият етиологичен агент, грамотрицателната бактерия Photobacterium damselae подс. piscicida, е отговорен за важни икономически загуби в култивираната риба по света, по-специално в средиземноморските страни и Япония. Усилията са насочени към по-добро разбиране на биологията на патогенния микроорганизъм и неговите естествени гостоприемници с цел разработване на ефективни стратегии за ваксиниране и диагностични инструменти за контрол на заболяването. Досега конвенционалната ваксинология дава незадоволителни резултати и се прилага рекомбинантна технология за идентифициране на нови кандидати за антиген за разработване на субединични ваксини. Освен това молекулярните методи представляват подобрение в сравнение с класическите микробиологични техники за идентифициране на P. damselae подс. piscicida и диагнозата на заболяването. Пълното секвениране, анотиране и анализ на патогенния геном ще даде представа за патогена, полагащ основите за разработването на ваксини и диагностични методи.

1. Въведение

Фотобактериозата или рибната пастерелоза е септицемия, причинена от грамотрицателната, халофилна бактерия Photobacterium damselae подс. piscicida, член на семейство Vibrionaceae, който споделя своя видов епитет Photobacterium damselae подс. damselae [1]. Фотобактериозата се счита за една от най-опасните бактериални болести в аквакултурата в световен мащаб поради широкия си диапазон от гостоприемници, високата смъртност и повсеместното разпространение [2]. Патогенът е в състояние да зарази голямо разнообразие от морски риби, включително жълтата опашка (Seriola quinqueradiata) в Япония, ореда (Sparus aurata), лаврак (Dicentrarchus labrax) и подметка (Solea senegalensis и Solea solea) в Европа, ивичест бас (Morone saxatilis), бял костур (Morone americana) и хибридни ивичести баси (Morone saxatilis (Моронови хризопи)) в САЩ, Кобия (Rachycentron canadum) в Тайван и златен помпано (Trachinotus ovatus) в Китай [3–5].

Разликите в чувствителността към болестта са описани въз основа на възрастта на рибите. Ларвите и младите са по-податливи на фотобактериоза, а острата инфекция предизвиква 90–100% смъртност на младата платика, докато рибите над 50 g са по-устойчиви поради по-ефективната фагоцитоза и убиването на бактериите от неутрофили и макрофаги [6]. Бактериите, които се намират в различни тъкани и във фагоцитите, причиняват хронични и остри форми на фотобактериоза. В своята остра форма мултифокалната некроза присъства в черния дроб, далака и бъбреците и бактериите се натрупват свободно във фагоцити, капиляри и интерстициални пространства. Хроничните лезии във вътрешните органи се характеризират с наличие на бели туберкули с диаметър около 0,3–0,5 mm [7].

Придържането и инвазивните способности са от съществено значение в първия етап на инфекцията [3]. P. damselae подс. piscicida е съобщено, че е слабо или средно прилепващо и инвазивно в различни рибни клетъчни линии, но показва висока способност за свързване с червата на рибите [8]. Изглежда, че адхезията се медиира от протеинов или гликопротеинов рецептор на повърхността на бактериалната клетка, а интернализацията на бактериите се осъществява чрез актинов микрофиламентозависим механизъм [8], като клетъчният метаболизъм играе активна роля [9]. Точният характер на механизма, отговорен за придържането и взаимодействието с рецепторите на гостоприемника и факторите на вирулентност, допринасящи за инвазията на рибните нефагоцитни клетки, все още е неизвестен [9].

Друг важен механизъм за вирулентност на P. damselae подс. piscicida е придобиването на желязо от неговия гостоприемник чрез използване на високоафинитетни свързващи желязо сидерофори, нискомолекулни желязо-хелатиращи молекули, които взаимодействат с бактериалните мембранни рецептори, за да транспортират желязото в бактерията [14]. освен това, P. damselae подс. piscicida е в състояние да придобива желязо от хемин и хемоглобин като уникални източници на желязо инвитро [14], а ограничаването на желязото води до повишено свързване на хемина във вирулентни щамове [15]. Поглъщането на хем от бактерията включва система TonB за транспортиране на хем в цитоплазмата и система за свързване на ATP-касета (ABC), която да го задвижва през цитоплазматичната мембрана [16, 17].

Малко се знае за имунния отговор на рибата към бактерията и факторите, отговорни за нейната неспособност да се предпази от P. damselae подс. piscicida. Наскоро се прилага транскриптомен подход за изясняване на ранните имунни отговори на младата ореда към P. damselae подс. piscicida инфекция. Бързото разпознаване на патогена се проявява чрез повишаване на регулирането на лектини, пептиди с антимикробна активност, хемокини и хемокинови рецептори, както и на протеина на желязото и метаболизма на хема като отговор срещу бактерии, които са зависими от желязото. Тази защитна реакция обаче може да бъде полезна или опустошителна за домакина [18]. Освен това се наблюдава повишено регулиране на гени с високоспециализирани супресивни функции, което показва активно потискане на имунитета, което може да бъде индуцирано от гостоприемника за намаляване на тъканните увреждания или от патогена да избегне отговора на гостоприемника [18].

2. Профилактика на P. damselae подс. piscicida Инфекция

Антибиотиците са първата линия на защита в рибните аквакултури за контрол на огнищата на фотобактериоза, но само след няколко години патогенът придобива резистентност към различни антибиотици. Всъщност различни прехвърляеми генетични елементи (R плазмиди), носещи гени за устойчивост срещу канамицин, сулфонамид, тетрациклин [19–22], ампицилин [22, 23], хлорамфеникол [22, 24], флорфеникол [25] и еритромицин [26 ] са документирани в P. damselae подс. piscicida. Различия в географското разпределение на многолекарствените преносими елементи са наблюдавани сред няколко щама, събрани в Япония и САЩ [22, 27]. Освен това вътреклетъчният паразитизъм на P. damselae подс. piscicida в рамките на макрофагите подкопава ефективността на химиотерапията.

Досега технологията на рекомбинантната ДНК и биотехнологичните подходи са били използвани в много ограничена степен за разработването на бактериални ваксини за риби и все още не съществуват ефективни превантивни мерки срещу рибната пастерелоза. Наскоро бяха съобщени проучвания за разработването на ваксини на субединицата в Кобия от Тайван P. damselae подс. piscicida изолат [4]. Имунопротеомика, използваща Western blot върху протеин, анализиран с 2DE и LC-MS/MS за изолиране на имунореактивни протеини, е приложена за идентифициране P. damselae подс. piscicida антигени, които след това са клонирани и произведени като рекомбинантни протеини. По-специално, беше показано, че три антигена предизвикват защитен ефект в кобията и следователно са докладвани като потенциални кандидати за ваксина за разработването на ваксина на субединицата срещу патогена. Защитата на тези кандидати за ваксина обаче не е проучена при други видове риби, където P. damselae подс. piscicida причинява сериозни заболявания и висока смъртност, а срещу други P. damselae подс. piscicida изолати [4]. Освен това са проучени антигенни комбинации, разкриващи, че бивалентните ваксини на субединицата могат да постигнат по-добра ефективност от моновалентните или тривалентните антигени [41].

Освен това селективното размножаване на рибни щамове, генетично устойчиви на фотобактериоза, представлява потенциална стратегия за намаляване на вероятността от избухване на болестта и избягване на драматичните последици от високата смъртност в рибните ферми [49]. Количественото картографиране на локусите на признаци се прилага за откриване на регионите на генома на гостоприемника, които са свързани с резистентност към болестта, а подпомогнатата от маркера селекция е полезен подход, използван в няколко вида аквакултури [50-52].

Изследване, изследващо количествени локуси на признаци за устойчивост на риба пастерелоза в оралата, идентифицира два значими количествени локуса на признака, един, който засяга късната преживяемост, а другият засяга общата преживяемост, и потенциален маркер за устойчивост на болести [49]. Идентифицирането на специфични за фазата количествени локуси на признаци при оредата подкрепя хипотезата за двуфазен защитен отговор с първична инфекция чрез експериментално излагане на патогена и вторична инфекция с бактерии, освободени от умираща и мъртва риба [49, 53]. Резултатите от количествените локуси на признаци, картографирани чрез идентифициране на региони от генома, които обясняват сложни черти като оцеляването, също могат да бъдат използвани за по-добро разбиране на механизмите на устойчивост на болести и защитен отговор. Допълнителни прозрения могат да бъдат получени и чрез сравнително картографиране с други видове, податливи на фотобактериоза.

3. Идентификация на P. damselae подс. piscicida и диагностика на инфекция

За да се преодолее проблемът с трудоемките и трудоемки процедури, през последните няколко години са разработени молекулярни методи, за да се постигне точна и специфична идентификация на P. damselae подс. piscicida и бърза диагностика на фотобактериоза (Таблица 2). Въпросът е силното сходство на ДНК ниво между двата подвида, което затруднява идентифицирането на последователности, полезни за проектиране на специфичен за подвид метод [3, 42, 57]. За тази цел са разгледани rRNA последователности [42], но са открити силни прилики както в 16S, 23S, и 5S (> 99%), така и в интергенните разделителни области (98–99,5%) между двата подвида на P. damselae. Освен това, подобната на мозайка структура на последните ги прави неподходящи за диагностични цели [42, 58]. Разработен е само метод, базиран на PCR на ниво вид, използвайки 16S последователности [42].