Д-р Xinli Li и д-р Junjie Xiao

сърдечна

Катедра по кардиология, Първата свързана болница на Медицинския университет в Нанкин,

300 Guangzhou Road, Nanjing 210029, (Китай) и Лаборатория за регенерация и стареене,

Експериментален център за науки за живота, Училище за наука за живота, Шанхайски университет,

333 Nan Chen Road, Шанхай 200444, (Китай)

Имейл [email protected] и E-Mail [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Острият миокарден инфаркт (ИМ), причинен от запушване на коронарните артерии, е честа причина за сърдечна дисфункция и сърдечна недостатъчност (СН) [1]. Ранното възстановяване на миокардната перфузия е основната цел на първоначалното лечение на пациенти с остър ИМ [1]. Понастоящем напредъкът във фармакологичната терапия и перкутанната коронарна интервенция може да възстанови коронарния поток при повечето пациенти за кратко време след появата на симптомите [2]. Самото възстановяване на притока на кръв обаче може да удължи сърдечното увреждане, явление, наречено реперфузионно увреждане [3,4]. Неблагоприятното левокамерно (LV) ремоделиране след остър ИМ, характеризиращо се с дилатация на LV и фиброза, е критичен определящ фактор за последващото развитие на СН [5]. Ремоделирането на ЛН също е важна патофизиологична характеристика при увреждане на исхемия-реперфузия (I/R) [6]. Следователно, идентифицирането на пътища, които ефективно предпазват от I/R нараняване и/или неблагоприятно ремоделиране, може да доведе до нови терапевтични подходи за смекчаване на LV ремоделиране и СН след остър ИМ.

Целта на рапамицин при бозайниците (mTOR) е важен медиатор на оста инсулин-PI3K-Akt в множество органи, включително сърцето [7]. mTOR образува два функционални комплекса: чувствителен към рапамицин mTOR комплекс 1 (mTORC1) и нечувствителен към рапамицин mTOR комплекс 2 (mTORC2) [8]. mTORC1 активира p70S6 киназа, която фосфорилира рибозомния протеин S6 и инхибира свързването на 4Е-свързващ протеин 1 (4EBP) с еукариотния фактор за инициация на транслация 4Е, което води до насърчаване на транслацията [9]. mTORC2 активира Akt, ключов регулатор на оцеляването на кардиомиоцитите, чрез фосфорилиране при Ser473 [10,11]. Предишни проучвания, използващи фармакологични mTOR инхибитори, включително рапамицин, и в двете in vivo и ex vivo модели на MI са открили противоречиви ефекти. Някои доклади демонстрират благоприятни ефекти от активирането на mTOR в I/R модели [12,13,14,15,16]; обратно, друг доклад описва кардиозащитни ефекти на инхибиране на mTOR [10]. По този начин ролята на mTOR в сърдечната функция и ремоделирането на ЛН след I/R увреждане остава недефинирана.

Капсулата Qiliqiangxin (QL) е китайско патентно лекарство, което е доказано ефективно и безопасно в нашето скорошно клинично изпитване за лечение на пациенти с хронична сърдечна недостатъчност [17]. QL включва 11 китайски билки, като Radix Astragali и Aconite Root съдържат основните активни съставки [18]. Известно е, че Radix Astragali отслабва неблагоприятното сърдечно ремоделиране след ИМ и хипертрофия [19]. Въпреки това дали QL има роля в сърдечната функция и ремоделирането на LV след нараняване на I/R остава неизвестно. Следователно, настоящото проучване има за цел да оцени благоприятните ефекти на QL върху I/R увреждането при мишки и да изследва потенциалните механизми.

Материали и методи

Животни

Осем до десет седмици мъжки мишки C57BL/6 (20-25 g) са получени от Лабораторния център за животни на Медицинския университет в Нанкин и са настанени с 12-часов цикъл на тъмно/светло и свободен достъп до храна в съответствие с разпоредбите за хуманно отношение към мишките. Това проучване отговаря на стандартите за грижа и използване на лабораторни животни (Център за лабораторни животни на Медицинския университет в Нанкин) и всички процедури са одобрени от Етичния преглед на приложението на лабораторни животни от Медицинския университет в Нанкин.

In vivo I/R модел

Моделът I/R е създаден съгласно предварително докладвани проучвания [20,21,22,23]. Накратко, животните бяха упоени i.p. с кетамин и севофлулен, интубиран и вентилиран. Извършена е лява торакотомия и лявата предна низходяща коронарна артерия (LAD) е лигирана с помощта на 7-0 копринени конци с участък от PE-10 тръби, поставен над LAD, на 1 мм от върха на нормално разположеното ляво предсърдие. След 45-минутна исхемия, LAD лигатурата беше освободена и реперфузията беше визуално потвърдена. По време на процедурата телесната температура се поддържа с плоча за затопляне 37 ° C. Оперираните мишки бяха евтаназирани на 1 и 7 ден след I/R за размер на инфаркта, фиброзна област и оценка на сигналния път. Фиктивни операции бяха извършени по подобен начин, но без да се зашива LAD.

In vivo QL и лечение с рапамицин

QL се предоставя от Shijiazhuang Yiling Pharmaceutical (Хъбей, Китай). Билковите лекарства са автентифицирани и стандартизирани с маркерни съединения съгласно Китайската фармакопея 2005 (Национален комитет по фармакопея, 2005). Прахът QL се разтваря в нормален физиологичен разтвор (NS). Мишките бяха рандомизирани за интрагастрално лечение с QL (0,5 g/kg/ден, n = 25) или NS (n = 25) [17,24,25]. На фалшиви оперирани мишки също се дава QL (0,5 g/kg/ден, n = 10) или NS (n = 10). Всички мишки са били лекувани три дни преди операцията и след това, до евтаназия. За да се изследва дали е необходимо активиране на mTOR за защитните ефекти на QL при I/R нараняване, Rapamycin (специфичен mTOR инхибитор, 5 mg/kg) се инжектира през опашната вена 10 минути преди сърдечния I/R в I/R + QL група.

Измерване на размера на инфаркта на миокарда

На 24 часа след I/R, мишките се упояват i.p. с 0,4 до 0,75 mg/g триброметанол. След това 1 ml синьо Evans (0,01 g/ml; BioSharp, Китай) бавно се инжектира в долната вена и сърцето се отстранява незабавно [26,27]. След съхранение в продължение на 10 минути при -20 ° С, сърцето се нарязва на 5 или 6 напречни резена (1 мм дебелина) по дългата ос. След това резените бяха оцветени с 1% трифенилтетразолиев хлорид (TTC, Amresco, САЩ) в разтвор на цитратен буфер (ph = 7.4) в продължение на 10 минути при 37 ° C, за да се очертае зоната на риск (AAR) [20,21,22, 23]. След това всички филийки бяха фиксирани с 4% параформалдехид, фотографирани и анализирани. Както беше съобщено по-рано [28,29], инфарктната зона (IA) изглеждаше бяла, докато неинфарктната, но рискова зона беше червена. Крайният размер на инфаркта се изразява като съотношение на IA към AAR, изчислено чрез компютърна планиметрия (Изображение J, версия 1.44, NIH, Bethesda, MD).

Измерване на ехокардиография

Сърдечната функция беше оценена на високочестотна ултразвукова система Vevo2100 (VisualSonics Inc, Toronto, ON, Canada) с 30 MHz централна честотна сканираща глава на 1 и 7 дни след I/R операция. Мишките бяха упоени с 1-2% изофлуранови пари в 1: 1 кислородна смес през конус на носа върху нагряваща подложка, за да се поддържа нормотермия. Фракцията на изтласкване на лявата камера (LVEF;%) и фракционното скъсяване на лявата камера (LVFS;%) бяха оценени съгласно насоките, придружаващи системата Vevo2100.

Хистологичен анализ

За да се оценят морфологичните промени и степента на сърдечна фиброза, сърцата бяха събрани на 7 дни след I/R, измити в PBS, фиксирани в 4% параформалдехид за една нощ и вградени в парафин. Всяко сърце се нарязва на участъци с дебелина 4 µm и се оцветява с хематоксилин и еозин (H&E) и трихром на Masson. Микрографиите са получени на светлинен микроскоп Nikon (Nikon, Япония).

Анализ на Western Blotting

На 24 часа след реперфузия се получава общ протеин от левокамерни миокардни тъкани след екстракция с лизисен буфер RIPA (P0013B, Beyotime, Китай). Концентрацията на протеин беше измерена с помощта на Pierce ™ BCA Protein Assay Kit (Thermo Scientific, САЩ). Общо 60 µg общ протеин бяха електрофорезирани и разделени на 4-12% SDS-PAGE и прехвърлени върху нитроцелулозни мембрани (Millipore, САЩ). Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко при стайна температура за един час и инкубирани през нощта при 4 ° C с първични антитела, отгледани при зайци срещу mTOR (1: 1000), фосфо-mTOR (Ser2448, 1: 1000), 4EBP ( 1: 1000), фосфо-4EBP (Ser65, 1: 1000), Akt (1: 1000), фосфо-Akt (Ser473, 1: 1000), закупени от Cell Signaling Technology (САЩ). След това мембраните бяха инкубирани с конюгирани с HRP вторични антитела (1: 2000; Cell Signaling Technology, САЩ) при стайна температура в продължение на два часа. Сигналите бяха открити с комплект SuperSignal ECL (Thermo, САЩ) в система за откриване на Western blotting (Bio-Rad, CA, USA). HRP-конюгиран моноклонален миши анти-GAPDH (1: 5000; KANGCHEN, Китай) се използва за количествено определяне на нивата на GAPDH. Резултатите бяха изразени като стойности на плътността, нормализирани към GAPDH.

Статистически анализи

Данните бяха представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Груповите различия бяха анализирани от двустранен студент т-тест. За множество сравнения се използва еднопосочен ANOVA с тест Bonferroni post hoc. Цялостната преживяемост на мишката след I/R беше оценена с помощта на криви на Kaplan-Meier и сравнена чрез log-rank тест. Всички статистически анализи бяха проведени с помощта на SPSS 15.0 или GraphPad Prism 5. P