Резюме

  • 2- [14C] DG, 2-дезокси-d- [1-14C] глюкоза
  • AMPK, AMP-активирана протеин киназа
  • ССЗ, сърдечно-съдови заболявания
  • GSK-3β, гликоген синтаза киназа-3β
  • HGP, производство на чернодробна глюкоза
  • 1H-MRS, 1H-магнитно-резонансна спектроскопия

За да се разбере сложната поредица от събития, развиващи се по време на развитието на свързания със затлъстяването диабет и ССЗ, настоящото проучване оценява времевия модел на инсулинова резистентност в отделни органи и сърдечна дисфункция по време на хронично хранене с високо съдържание на мазнини при мишки C57BL/6. Използвайки in vivo техниките на хиперинсулинемично-евгликемична скоба, 1 Н-магнитно-резонансна спектроскопия (1 H-MRS) и ехокардиография, индуцирани от диетата промени в действието на инсулина, глюкозно-липидния метаболизъм, телесния състав и сърдечната функция при отделни индивиди органи на будни мишки.

разкриване

ПРОЕКТИРАНЕ И МЕТОДИ НА ИЗСЛЕДВАНИЯТА

Проучване 1: Промени в действието на инсулина и метаболизма на глюкоза/липиди в отделни органи по време на хронично хранене с високо съдържание на мазнини при мишки C57BL/6.

Мъжки мишки C57BL/6 (n = 5∼10) на възраст ∼8 седмици бяха закупени от лабораторията Джаксън (Bar Harbor, ME) и настанени при контролирана температура (23 ° C) и светлина (12 часа светлина [0700–1900 ] и 12 часа тъмно [1900–0700]) условия. Мишките бяха хранени с високо съдържание на мазнини (55% мазнини в калории; Harlan Teklad, Madison, WI) ad libitum за 0 (контрола), 1,5 (10 дни), 3, 6 или 20 седмици. Храненето с високо съдържание на мазнини е започнало на различна възраст за всяка група мишки, за да се проведат експерименти с мишки, съответстващи на възрастта (на възраст 6-7 месеца). Най-малко 4 дни преди експериментите in vivo, масите на цялото тяло и чистата маса се измерват при будни мишки, съобразени с възрастта, с помощта на 1 H-MRS (Bruker Mini-Spec Analyzer; Echo Medical Systems, Houston, TX). След анализ на техния телесен състав, мишките бяха обезболени и беше извършена операция за установяване на постоянен катетър в дясната вътрешна югуларна вена (31). В деня на експеримента със скоби, мишките бяха поставени в ограничител с размер на плъх, както беше описано по-рано (31). Всички процедури бяха одобрени от Комитета за грижа и употреба на животните в Йейлския университет.

Хиперинсулинемично-евгликемични скоби за оценка на инсулиновото действие in vivo.

След като мишките бяха на гладно през нощта (~ 15 часа), беше проведена 2-часова хиперинсулинемично-евгликемична скоба с непрекъсната инфузия на инсулин (15 pmol · kg -1 мин. -1; Humulin; Eli Lilly, Indianapolis, IN) и променлива инфузия на 20% глюкоза (31). Основният и стимулиран от инсулин оборот на глюкозата в цялото тяло се изчислява с непрекъсната инфузия на [3- 3 H] глюкоза (PerkinElmer, Бостън, Масачузетс) в продължение на 2 часа преди и през скобите (31). За да се оцени стимулираното от инсулин усвояване на глюкоза в отделни тъкани, 2-дезокси-d - [1- 14 C] глюкоза (2- [14 C] DG; PerkinElmer) се прилага като болус (10 μCi) 75 минути след началото на скобите. В края на скобите мишките се упояват и тъканите им се вземат за биохимичен и молекулярен анализ (31).

Биохимични и молекулярни анализи.

Концентрациите на глюкоза и инсулин по време на скоби се измерват, както е описано по-горе (31). Плазмените концентрации на [3- 3 H] глюкоза, 2- [14 C] DG и 3 H2O бяха определени след депротеинизиране на плазмени проби. Радиоактивността на 3 H в тъканния гликоген и тъканно специфичното съдържание на 2- [14 C] DG-6-фосфат се определя, както е описано по-рано (31). Сърдечни проби бяха получени в края на скобите, за да се оцени медиираното от инсулин фосфорилиране на Akt и общите нива на GLUT4 (32). Други мишки са хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 0, 1,5 или 3 седмици (n = 5–10), за да се оценят нивата на обща и фосфорилирана AMP-активирана протеин киназа (AMPK) в сърцето (33). Концентрациите на триглицериди, специфични за тъканите, се определят чрез смилане на тъканни проби в хлороформ-метанол и използване на набор за анализ на триглицериди (Sigma, Сейнт Луис, МО) (34).

Изчисления.

Степените на базално чернодробно производство на глюкоза (HGP) и стимулирано от инсулин усвояване на глюкоза в цялото тяло се определят, както е описано по-рано (31). Стимулираната от инсулина скорост на HGP по време на скоби се определя чрез изваждане на скоростта на вливане на глюкоза от усвояването на глюкоза в цялото тяло. Гликолизата на цялото тяло и гликогенът плюс синтеза на липиди от глюкоза се изчисляват, както е описано по-рано (31). Стимулираното от инсулин усвояване на глюкоза в отделни тъкани се оценява чрез определяне на съдържанието на тъкан (напр. Скелетни мускули, сърце) на 2- [14 C] DG-6-фосфат и плазмения 2- [14 C] DG профил. Инсулин-стимулираната гликолиза и синтеза на гликоген в скелетните мускули са изчислени, както е описано по-рано (31).

Проучване 2: Промени в плазмените адипокини и сърдечните фенотипове при мишки C57BL/6, хранени с нормална или богата на мазнини диета.

Проведени са надлъжни проучвания при мъжки, съпоставени с възрастта мишки C57BL/6 (получени на възраст ∼8 седмици), хранени с нормална (n = 5-10) или диета с високо съдържание на мазнини (n = 4-10). Проведени са поредица от неинвазивни експерименти при отделни мишки на 0, 1,5, 3, 10, 15 и 20 седмици от съответното диетично хранене. Концентрациите на мастните киселини в плазмата и триглицеридите се определят, като се използва съответно колориметричен комплект на базата на ацил-КоА оксидаза (Wako, Richmond, VA) и набор за анализ на триглицериди. Плазмените нива на адипонектин, лептин и резистин се измерват, като се използват съответните ензимно-свързани имуносорбентни комплекти за анализ (Linco, St. Charles, MO). Ехокардиографията в М-режим беше извършена с помощта на Phillips Sonos 5500 System с 15-MHz сонда при мишки, леко анестезирани с инхалиран изофлуран. Изображенията са събрани в късите и дългите оси; данните представляват осреднените стойности на 3∼5 сърдечни цикъла. Интрамиокардиалните нива на мастни ацил-CoAs бяха измерени с помощта на тандемен масспектрометър PerkinElmer/Sciex API 3000, както е описано по-рано (31).

Статистически анализ.

Данните са изразени като средни стойности ± SE. Значимостта на разликата в средните стойности между мишки, хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 0 седмици (контроли) и тези, хранени с диета за 1,5, 3, 6 или 20 седмици, беше оценена с помощта на теста на Дънкан за многократен обхват (проучване 1). Значимостта на разликата в средните стойности между мишки, хранени с високо съдържание на мазнини или нормална диета в продължение на 0 или 1,5 в сравнение с 3, 10, 15 или 20 седмици, също беше оценена с помощта на тест на Дънкан за многократен обхват (проучване 2). Статистическата значимост беше определена при P1H-MRS при будни мишки, бяха значително повишени след 1,5 седмици (10 дни) хранене с високо съдържание на мазнини и допълнително се увеличиха след това (Таблица 1 и Фигура 1А). За разлика от това, чистата маса на цялото тяло не се променя при хранене с високо съдържание на мазнини (фиг. 1В). Базалните плазмени нива на глюкоза при гладували през нощта животни са склонни да се увеличават след 3 и 6 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, но не достигат статистическа значимост (Таблица 1). Базалните плазмени нива на инсулин са се увеличили два пъти след 3 и 6 седмици хранене с високо съдържание на мазнини (фиг. 1С). Въпреки това, след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, плазменият инсулин е спаднал до нива, сравними с тези на мишки, хранени с нормална диета, което предполага декомпенсация на функциите на бета-клетките на панкреаса (Таблица 1).

Метаболизъм на цялото тяло по време на хиперинсулинемично-евгликемични скоби.

За да се определят индуцираните от диетата промени в действието на инсулина и метаболизма на глюкозата in vivo, беше проведена 2-часова хиперинсулинемично-евгликемична скоба на будни, съобразени с възрастта мишки C57BL/6, хранени с диета с високо съдържание на мазнини за различни периоди от време. Стационарните нива на инфузия на глюкоза, необходими за поддържане на евгликемия по време на скоби, бяха значително намалени след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, по това време също се появи базална хиперинсулинемия (Фиг. 2А). Индуцирана с диета инсулинова резистентност на цялото тяло беше допълнително демонстрирана с [3 H] глюкозен обмен по време на скоби, който показа ∼30% намаление на стимулираното от инсулин усвояване на глюкоза в цялото тяло след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини (фиг. 2В) . В съответствие с промените в усвояването на глюкозата в цялото тяло, стимулираният от инсулин гликоген в цялото тяло плюс синтеза на липиди от глюкоза намалява с ∼30% след 6 седмици хранене с високо съдържание на мазнини (фиг. 2С) и стимулираното от инсулин цяло тяло гликолизата показва тенденция към намаляване след 3 и 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини (фиг. 2D).

Стимулиран от инсулина метаболизъм на глюкозата в скелетните мускули, мастната тъкан и черния дроб.

Базалният HGP постепенно намалява по време на хранене с високо съдържание на мазнини и е значително намален след 20 седмици от тази диета (Таблица 1), резултат, който е в съответствие с тенденцията нивата на глюкоза в плазмата при животни на гладно през нощта да намаляват след 20 седмици на високо хранене с мазнини. Инсулин-медиираното потискане на базалния HGP (т.е. чернодробно инсулиново действие) е намалено с ∼40% след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, а чернодробната инсулинова резистентност е допълнително влошена след това (Фиг. 4С). До 20-седмично хранене с високо съдържание на мазнини инсулинът не успява да потисне напълно HGP; този ефект е свързан с двукратно увеличение на нивата на интрахепаталните триглицериди (фиг. 4D) (34,35). В интересна находка, чернодробната инсулинова резистентност, наблюдавана след 3 и 6 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, не е свързана със значителна промяна в съдържанието на чернодробни триглицериди, което предполага, че други механизми са отговорни за краткосрочната, индуцирана от диетата чернодробна инсулинова резистентност.

Глюкозен метаболизъм и инсулинова сигнализация в сърцето.

Надлъжни промени в метаболитните параметри при хронична диета с високо съдържание на мазнини или норма.

Проведени са надлъжни проучвания при допълнителни групи мъжки мишки, съобразени с възрастта, C57BL/6, които са били хранени хронично с нормална или богата на мазнини диета. След това бяха проведени поредица от неинвазивни експерименти при отделни мишки на 0, 1,5, 3, 10, 15 и 20 седмици от съответното диетично хранене. Масата на цялото тяло се увеличава два пъти след 20 седмици нормална диета, отразявайки свързаната с възрастта промяна (Таблица 2). За разлика от това, мастната маса на цялото тяло се е увеличила два пъти след 10 седмици хранене с високо съдържание на мазнини и допълнително се е увеличила до повече от шест пъти над базовите (преди хранене с високо съдържание на мазнини) след 20 седмици хранене с мазнини. От друга страна, слабата маса на цялото тяло показва подобен модел на увеличаване след нормална диета с високо съдържание на мазнини (Таблица 2).

Циркулиращите нива на глюкоза, мастни киселини и триглицериди не се променят през 20 седмици от нормалната диета. За разлика от това, диетата с високо съдържание на мазнини причинява значително повишаване на плазмените нива на мастни киселини и глюкоза, съответно след 15 и 20 седмици на хранене (фиг. 6А и В). Индуцирано от диетата начало на базална хипергликемия и по този начин диабет, след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини е в съответствие с намалените нива на инсулин в плазмата и предполага затъпен панкреатичен β-клетъчен отговор (т.е. декомпенсация на β-клетките). Циркулиращите нива на триглицеридите показват тенденция към повишаване след 15 и 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, но тази разлика не достига статистическа значимост (Таблица 2).

Надлъжни промени в сърдечната функция и структура при хронична диета с високо съдържание на мазнини или нормална.

За да се определят ефектите от хроничното хранене с високо съдържание на мазнини върху сърдечната функция in vivo, временният модел на промени в сърдечната функция е оценен с помощта на ехокардиограма. Фракционното скъсяване на вентрикулите не е променено при мишки C57BL/6, хранени с нормална диета в продължение на 20 седмици (фиг. 7А). За разлика от тях, фракционното скъсяване на вентрикулите постепенно намалява след 10-15 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, като разликата достига статистическа значимост след 20 седмици хранене с мазнини в сравнение с храненето с нормална диета (фиг. 7А). В допълнение, фракционното скъсяване на вентрикулите е намалено при отделни мишки C57BL/6, хранени с диета с високо съдържание на мазнини в продължение на 20 седмици, в сравнение със същите мишки след 3 седмици диета с високо съдържание на мазнини (Фиг. 7В). Представителни ехокардиографии на мишки, хранени с нормална или богата на мазнини диета в продължение на 20 седмици, са показани на фиг. 7C и D.

Дебелината на стената на интервентрикуларната преграда в края на диастолата не се променя след 20 седмици нормално хранене или хранене с високо съдържание на мазнини в сравнение с след 3 седмици от съответната диета (фиг. 8А). За разлика от това, дебелината на задната стена на лявата камера в края на диастолата е значително увеличена при мишки след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини в сравнение с след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, докато не е променена след 20 седмици нормална диета хранене (фиг. 8Б). Сърдечното тегло е значително увеличено с ~ 20% след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини в сравнение с след 20 седмици нормално хранене с диета (фиг. 8C, ляв панел). Когато обаче теглото на сърцето се нормализира до чиста маса на цялото тяло, резултатите не се различават между двете групи мишки (фиг. 8С, десен панел).

Тъй като натрупването на липидни метаболити в миокарда е свързано с диабетна кардиомиопатия (39,40), ние измерихме интрамиокардни нива на мастни ацил-CoAs след 20 седмици с високо съдържание на мазнини или нормална диета. Интрамиокардиалните нива на мастните ацил-КоА са или значително намалени (С18: 2 и С18: 3), или показват тенденция към намаляване след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини в сравнение с след 20 седмици нормална диета (фиг. 8D). Тези резултати предполагат, че хроничното хранене с високо съдържание на мазнини е променило метаболизма на сърдечните липиди и че повишените нива на мастни ацил-CoAs не са отговорни за променените сърдечни функции. Освен това гликоген синтазата киназа-3β (GSK-3β) е повсеместно експресирана кардиопротективна серин/треонин киназа и е доказано, че променената експресия или активност на GSK-3β предизвиква сърдечна хипертрофия (41). Общите нива на протеин на GSK-3β и фосфорилиран GSK-3β не се променят при мишки, хранени с високомаслена диета в продължение на 1,5 или 20 седмици, в сравнение със съответните мишки, хранени с нормална диета (данните не са показани), което предполага, че GSK-3β− свързаното сърдечно хипертрофично сигнализиране може да не е отговорно за индуцирана от диетата промяна в сърдечната функция/структура.

ДИСКУСИЯ

От ранното наблюдение на Суини (42), че диетичните фактори влияят върху глюкозния толеранс, причинно-следствената връзка между затлъстяването и инсулиновата резистентност е изчерпателно изследвана. Това, което остава неубедително, е как медиираната от липиди инсулинова резистентност възниква в различни органи и как тя е свързана със сърдечно-съдови усложнения. Изследване на Kraegen et al. (43) установи, че инсулиновата резистентност се развива в черния дроб и мастната тъкан, преди да се развие в скелетните мускули по време на хронично хранене с високо съдържание на мазнини при плъхове Wistar. За разлика от това, нашите резултати показват, че индуцирана от диета инсулинова резистентност в скелетните мускули, мастната тъкан и черния дроб се развива едновременно (след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини) при мишки C57BL/6. Тези противоречиви констатации може да се дължат на разликите в животинските видове (плъхове спрямо мишки) и/или диетата с високо съдържание на мазнини, използвана във всяко проучване. Значението на нашите констатации е, че те предполагат, че общ механизъм, вторичен за повишеното затлъстяване, може да бъде отговорен за инсулиновата резистентност в отделни органи при мишки.

Нашето откритие, че сърдечната инсулинова резистентност е вторична спрямо притъпената активност на Akt, показва, че Akt, инсулиново-сигнална молекула след субстрата на инсулиновия рецептор и фосфатидилинозитол 3-киназата, е важен медиатор на сърдечния метаболизъм на глюкозата. В парадоксална находка наскоро беше показано, че мишките със специфична за сърцето свръхекспресия на Akt развиват камерна хипертрофия, свързана с променен сърдечен метаболизъм на глюкозата (50). По този начин, въпреки че намалената активност на Akt вероятно ще играе роля в промените в сърдечния глюкозен метаболизъм, предизвикани от диетата, хроничните ефекти на Akt върху сърдечната функция и структура остават неясни. В нашето проучване, стимулираното от инсулин поглъщане на сърдечна глюкоза драстично намалява след 1,5–3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини (∼60% промяна) въпреки сравними нива на активност на Akt, което предполага, че други фактори могат да обяснят индуцираната от диета сърдечна инсулинова резистентност. В тази връзка, нашата констатация, че общите нива на експресия на миокарден GLUT4 са значително намалени след 1,5 и 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, предполагат ролята на намалената GLUT4 и Akt-свързана инсулинова сигнализация в индуцирана от диета сърдечна инсулинова резистентност.

Като цяло нашите резултати показват, че инсулиновата резистентност се развива едновременно в скелетните мускули, мастната тъкан и черния дроб след 3 седмици хранене с високо съдържание на мазнини при мишки C57BL/6 и е свързана със значително повишаване на нивата на интрамускулен триглицерид и циркулиращ резистин. Индуцираната от диета сърдечна инсулинова резистентност се развива преди промени в хомеостазата на глюкозата в цялото тяло и вторично вследствие на дефекти в Akt-медиирана инсулинова сигнализация и експресия на GLUT4. Тъй като сърдечната функция не беше значително притъпена чак след 20 седмици хранене с високо съдържание на мазнини, нашите открития предполагат, че сърдечната инсулинова резистентност сама по себе си не медиира сърдечната дисфункция при мишки с високо съдържание на мазнини. Вместо това, хронично промененият сърдечен метаболизъм на глюкозата и адипокините могат да изострят вредните ефекти на повишеното окисление на липидите, а медиираната от липотоксичната кардиомиопатия може да доведе до спад в сърдечната функция.