Принадлежности Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Ирландия, Център за хранителни фармабиотици, Университетски колеж Корк, Корк, Ирландия, Микробиологичен отдел, Университетски колеж Корк, Корк, Ирландия

анализ

Асоциация Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Ирландия

Принадлежности Хранителен фармабиотичен център, Университетски колеж Корк, Корк, Ирландия, Микробиологичен отдел, Университетски колеж Корк, Корк, Ирландия

Принадлежности Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Ирландия, Хранителен фармабиотичен център, University College Cork, Cork, Ирландия

Принадлежности Teagasc Food Research Center, Moorepark, Fermoy, Ирландия, Хранителен фармабиотичен център, University College Cork, Cork, Ирландия

  • Алън Дж. Марш,
  • Орла О’Съливан,
  • Колин Хил,
  • Р. Пол Рос,
  • Пол Д. Котър

Фигури

Резюме

Цитат: Marsh AJ, O’Sullivan O, Hill C, Ross RP, Cotter PD (2013) Базиран на секвениране анализ на бактериалния и гъбичен състав на кефирните зърна и млека от множество източници. PLoS ONE 8 (7): e69371. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0069371

Редактор: Колин Дейл, Университет в Юта, Съединени американски щати

Получено: 24 март 2013 г .; Прието: 7 юни 2013 г .; Публикувано: 19 юли 2013 г.

Финансиране: Хранителният фармабиотичен център е изследователски център, финансиран от Научна фондация Ирландия (SFI), чрез Националния план за развитие на ирландското правителство. Авторите и тяхната работа са подкрепени с безвъзмездна помощ от SFI CSET APC CSET 2 безвъзмездна 07/CE/B1368. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Кефирът е ферментирала напитка на основата на мляко. Това е вискозна, самогазирана, кисела напитка, която съдържа нисък процент алкохол и се смята, че произхожда от Кавказките планини преди около 2000 години. Млякото се ферментира от твърда, подобна на карфиол, полизахаридна матрица, известна като кефирно зърно, която се използва повторно, за да започне последваща ферментация. Зърното е съставено предимно от бактериално произведен кефиран [1], който съдържа в себе си сложен консорциум от бактерии и дрожди, които работят в симбиоза за ферментация на млякото [2].

Въпреки несъмнената стойност на гореспоменатите проучвания, културно-базираните анализи са ограничени по силата само на откриване на видове с възможност за растеж върху специфичната използвана среда. По този начин, независимите от културата техники имат потенциала да осигурят по-точен и задълбочен анализ. Въпреки че са използвани независими от културата техники като последователността на Sanger [12], [16], [20], [21] и DGGE [14], [15], [22], за изследване на популацията на кефира, прилагането на високо -последователността на ДНК за изследване на такива микробни екосистеми е особено важно развитие. Тази стратегия е използвана за изследване на микробния състав на редица ферментирали хранителни среди като сирене [23], [24], ферментирала риба [25], [26], ферментирали зеленчуци [27], оризови трици [28] и каша от перлено просо [29]. Всъщност наскоро беше използвано високопроизводително ДНК секвениране, за да се получи по-цялостно разбиране на бактериалната популация на едно ирландско кефирно зърно и мляко и три бразилски кефирни зърна [30], [31].

Освен идентифицирането на потенциално популяризиращи здравето популации, комерсиализацията на производството на кефир може да се възползва от получаването на подробно разбиране на свързаните с тях микробни популации. Необходимо е също да се оцени хетерогенността на тези популации в голям брой зърна и по-специално да се използват молекулярни подходи за по-добра характеристика на свързаните популации с дрожди. В светлината на тези изисквания целта на настоящото проучване беше да се използват техники за последователност с висока производителност, за да се осигури задълбочен анализ на микробния консорциум от 25 различни зърна и мляко от кефир, получени от различни източници, за да се сведе до минимум всяка географска пристрастност които могат да повлияят на флората. Това проучване представлява първият случай, при който тази технология е приложена към толкова голям брой проби от кефир и е първото по рода си изследване, което разкрива гъбичния компонент на кефира.

Материали и методи

Поддържане на културата

9 ирландски кефирни зърна бяха възстановени от -80 ° C в хранилището на Teagasc Culture Collection чрез ферментация в 10% възстановено обезмаслено мляко (RSM), което беше стерилизирано при 115 ° C в продължение на 15 минути. Те първоначално са придобити от домакини в цялата страна [18] и за целите на това проучване са обозначени IR1, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9 и 10. Допълнителни 16 зърна са получени от индивидуални и търговски доставчици от редица различни места (Таблица S1) и отглеждани при еднакви условия. Пробите от Обединеното кралство бяха означени UK1 до UK5, а пробите от Съединените щати - US1, 2, 3 и 5. Други зърна кефир бяха снабдени от Испания (Sp1), Франция (Fr1), Италия (It1), Канада (Ca1 ) и Германия (Ger1 и Ger2). Културите се поддържат при стайна температура и се инокулират в прясно мляко 3 пъти седмично, минимум 4 месеца преди екстракцията.

Метагеномна екстракция на ДНК

100 ml 10% RSM се инокулира с 1 g кефирно зърно и ферментира при 25 ° C в продължение на 24 часа, времето, в което кефирът се приготвя най-често. За да се извлече ДНК от кефира, 1,8 ml ферментирало мляко се центрофугира, за да се генерира гранула, която се суспендира в 450 ul лизисен буфер Р1 от Powerfood Microbial DNA Isolation kit (MoBio Laboratories Inc, USA). Ресуспендираната пелета беше подложена на ензимно разграждане с ензими мутанолизин (100 U/ml) и лизозим (50 µg/ml) при 37 ° C за 1 час, последвано от разграждане на протеиназа К (250 µg/ml) при 55 ° C за 1 час. Екстракцията е оптимизирана с 10-минутна инкубация 70 ° C [40] преди механичен лизис с помощта на Qiagen TissueLyser II (Retsch®). След това беше използван комплектът за изолиране на микробиална ДНК Powerfood съгласно инструкциите на производителя. Чистата ДНК се елуира в HPLC клас стерилна вода. ДНК от кефирно зърно се изолира, като се използва модифицирана процедура на екстракция на базата на фенол-хлороформ [22].

ДНК амплификация и пиросеквенция

Анализ на пиросеквениране на данни

Резултати

Бактериалната популация на кефирното мляко е по-последователна и по-малко разнообразна от тази на съответните зърна

Филтриране след качество, 106 235 и 136 815 отчитания за 23 зърна и съответно 23 проби от мляко, съответно останаха, което се равнява на средно 4619 отчитания за всяка зърнена проба и 5949 отчитания за проба от мляко.

Изчислени са стойностите на Chao1 (отразяващи OTU/богатството на видовете), индексите на Шанън и Симпсън (за определяне на видовото разнообразие), както и числата на филогенетичното разнообразие и наблюдаваните видове (Таблица S2). Кривите на разреждане, изчислени при 97% сходство, се приближават успоредно на оста x за всички проби, което показва, че са получени достатъчно четения за адекватна оценка на популацията (Фигура S1). Анализът показва, че бактериалната популация в кефирното мляко обикновено е по-малко разнообразна от тази в зърната на кефира (Фигура S2), където средната стойност (черна лента) за млякото е по-ниска във всички показатели, с изключение на Шанън индекс. Единствената значителна разлика между зърното и млякото е във филогенетичното разнообразие (p 2 = 0,924, p = 0,644, фигура 2А). Приликите между кефирните зърнени общности не са същите като приликите между кефирните общности.

Зелен = ирландски кефир, оранжев = белгийски кефир, светлокафяв = испански кефир, червен = немски кефир, сив = американски кефир, розов = италиански кефир и лилав = британски кефир.

Двата различни типа проби са свързани с лента (бялото представлява зърнена флора; червеното представлява млечната флора). Посоката на всяка ос е произволна.

Алфа-разнообразието на гъбични популации в кефирните млека и зърната варира, но бета-разнообразието на кефирните зърна е по-голямо от това на млякото

Генерирани са филтриране на качество след комбинирано общо 118 879 и 118 976 четения, съответстващи на 23 зърнени и съответно 23 популации мляко. Това се равнява на средно прочетено число съответно 5167 и 5173 на проба зърно и мляко.

Стойностите на алфа разнообразието установяват, че има естествено ниско разнообразие в зърната и млякото на кефира (Таблица S3). Анализът на индексите Chao1, наблюдавани видове и филогенетично разнообразие показва, че разнообразието е по-голямо в млякото от кефир, отколкото в зърната (Фигура S3). Статистическата разлика между двете обаче е ограничена до филогенетично разнообразие (p 2 = 0,855, p = 0,139, фигура 2B).

Кефирните зърна и свързаните с тях ферментирали кефир млека се доминират от относително малък брой бактериални поколения

ITS секвенирането предоставя подробен поглед върху гъбичния състав на кефирните зърна и свързаните с тях ферментирали кефир млека

Единственият гъбен вид, определен в зърното, е Ascomycota, най-големият вид на гъбичното царство. Показано е също така, че аскомикотите доминират в кефирното мляко, варирайки от висок 100% в Ger1 до нисък от 89,38% в Ir10 (Таблица S6; Таблица S7). Basidiomycota, другият тип, принадлежащ към подцарството Dikarya, е открит в 9 проби от мляко при сравнително ниски отчетени числа. 9 от пробите мляко също съдържат следи от некултивирани гъби. По-ниското разнообразие в зърното отново е очевидно на семейно ниво, където всички проби освен една (Sp1) съдържат> 99% Saccharomycetaceae. Общият среден дял на Saccharomycetaceae е значително по-нисък в млеката (р 99% от четенията в 16 от 23 проби. Гъбичният състав на кефирното мляко Sp1 е необичаен поради съдържанието на 34,27% Pichiaceae. За разлика от това, следващият най-голям дял от Pichiaceae е 0,48% (в млякото UK3). Други гъбични семейства открити в двете млека кефирни и зърната са Davidiellaceae и Trichocomaceae. Herpotrichiellaceae, Teratosphaeriaceae, Valsaceae, Debaryomycetaceae, Phaffomycetaceae, Malasseziaceae, Bondarzewiaceae, Dermataceae, Pezizaceae, Ganodermataceae, Tricholomataceae, Tremellomycetes. В допълнение, Wallemiomycetes са открити само в млека, докато Dothioraceae са открити само в зърната.

За разлика от 16S четенията, които са обект на високо ниво на хомология на последователността, ITS четенията са достатъчно различни, за да позволят присвояване на ниво вид. Таблица 1 показва общия брой на идентифицираните различни видове и дали е имало предишна връзка с кефир. Профилът на популацията на видово ниво силно отразява този на ниво род. Най-често срещаният вид, Kazachstania unispora, присъства в 20 зърна и всички млека. Всички отчитания от родовете Kluyveromyces и Naumovozyma са разпределени съответно на видовете Kluyveromyces marxianus и Naumovozyma castelli (Таблица S6; Таблица S7). Въпреки че родът Saccharomyces е идентифициран в малки количества в редица зърнени храни и млека, само тези в Ir5 са определени на видово ниво (към Saccharomyces cerevisiae).