Допринесе еднакво за тази работа с: Ming Li, Dianbin Yang

нуклеозиди

Отделение по микроекология, Факултет по основни медицински науки, Медицински университет Далиан, Далиан, Ляонин, Китай

Допринесе еднакво за тази работа с: Ming Li, Dianbin Yang

Отделение по микроекология, Факултет по основни медицински науки, Медицински университет Далиан, Далиан, Ляонин, Китай

Катедра по микроекология, Школа по основни медицински науки, Медицински университет Далиан, Далиан, Ляонин, Китай, Катедра по гастроентерология, Втората свързана болница на Университета в Джънджоу, Джънджоу, Хенан, Китай

Присъединителен факултет по селскостопански, битови и екологични науки, Университет на Алберта, Едмънтън, Алберта, Канада

Отделение по микроекология, Факултет по основни медицински науки, Медицински университет Далиан, Далиан, Ляонин, Китай

Отделение по микроекология, Факултет по основни медицински науки, Медицински университет Далиан, Далиан, Ляонин, Китай

  • Минг Ли,
  • Дианбин Ян,
  • Лу Мей,
  • Лин Юан,
  • Ао Сие,
  • Jieli Yuan

Фигури

Резюме

Скрининг на разграждащи LAB щамове на гуанозин и инозин

Използвана е система за HPLC разтвор за едновременно откриване на инозин и гуанозин. Процедурата е следната: 33,7 mg инозин и 35,7 mg гуанозин се разтварят в 100 ml разтвор на K3PO4 (100 mmol/L, pH = 7,0), за да се получи разтвор на инозин-гуанозин. След филтриране (0.22 µm), 5, 10, 15 и 20 µL инозин-гуанозинови разтвори се инжектират в HPLC устройство (LC-20A, Shinadzu Corporation, Япония), оборудвано с детектор с променлива дължина на вълната и Cosmosil-5C18-AR- II колона (4,6 × 250 mm, Cosmosil, Япония). Изократичното елуиране се извършва с разтвор на NaClO4-H3PO4 (0.1 µmol/L NaClO4 и 0.187 mol/L H3PO4 в dH2O), при скорост на потока 1 mL/min. Съдържанието на инозин и гуанозин се идентифицира при 254 nm чрез време на задържане съответно от 14.906 и 10.889 минути и се определя количествено чрез интерполация на калибрационните криви. Изведените стандартни криви бяха Aino = 5 × 10 7 Cino + 22844, R = 0.9999 и Agua = 5 × 10 7 Cgua-10822, R = 0.9999. A: пикова площ, C: концентрация (g/L).

За да се оцени способността за усвояване на инозин и гуанозин, щамът LAB се инокулира в MRS и се култивира в продължение на 48 часа при 37 ° С при анаеробни условия. 2 мл от културалния бульон се центрофугират при 4000 х g, 4 ° С в продължение на 10 минути. След това клетките се измиват два пъти с 1 ml 0,85% NaCl, ресуспендират се със 750 ul разтвор на инозин-гуанозин и се инкубират при 37 ° С в продължение на 60 минути, с разклащане (120 rpm). След това разтворът се центрофугира при 4000 х g, 4 ° С в продължение на 10 минути. 270 ul от супернатантата бяха отстранени. 30 uL HCI04 (0.1 mol/L) се добавят към супернатанта, разбъркват се старателно, за да се предотврати по-нататъшно разграждане. 20 ul от сместа се инжектират в HPLC устройството след филтриране. Останалото съдържание на инозин и гуанозин се изчислява по формулата, изведена по-горе. Скоростта и скоростта на разграждане на инозин или гуанозин от различни LAB щамове бяха изчислени съгласно следната формула: V = (0.9C-X)/60, α = [(0.9C-X) /0.9C] • 100%. V: скорост на разграждане (g/L/min), X: останалото съдържание на инозин или гуанозин (g/L).

За да се оцени разграждането на пуриновите съединения чрез екстракти от LAB без клетки, 2 ml от културалния бульон се центрофугират при 4000 х g, 4 ° С в продължение на 10 минути. След това клетките се измиват два пъти с 1 ml 0,85% NaCl, ресуспендират се със 750 µL разтвор на инозин-гуанозин и се обработват с ултразвук, както е описано от Feliu et al [21]. След това екстрактите се инкубират при 37 ° С в продължение на 60 минути и 120 минути, с разклащане (120 rpm). Съдържанието на инозин и гуанозин бяха анализирани чрез HPLC, както бе споменато по-горе.

Характеризиране на кандидат щамове като потенциални пробиотици

Толерантност към киселини.

Устойчивостта на киселинни условия беше тествана чрез инокулиране на 10 8 CFU/mL (крайна бактериална концентрация) на LAB в MRS бульон с различни стойности на рН [22]. РН на MRS се регулира на 2.0, 3.0 и 4.0, като се използва 0.1 N HCI. След култивиране в продължение на 4 часа при 37 ° С се извършват серийни разреждания и растежът на бактериалните щамове се записва чрез броене на жизнеспособни плаки. Този анализ се извършва в три екземпляра.

Толерантност на жлъчката.

Разтворите на жлъчната сол се приготвят с използване на прах от волски жлъчки (Sigma, St. Louis, Mo, USA) при крайни концентрации от 0,1%, 0,2% и 0,3% [23]. 10 8 CFU/ml (крайна бактериална концентрация) от прясно приготвен LAB се инокулират в 10 ml от автоклавираните разтвори и се инкубират при 37 ° С в продължение на 4 часа преди броене на жизнеспособни плаки. Този анализ се извършва в три екземпляра.

Поносимост към пепсин и трипсин.

10 8 CFU/ml (крайна бактериална концентрация) от прясно приготвени LAB култури са инокулирани в MRS бульон с различни концентрации на пепсин (0,59 µg/ml, 0,72 µg/ml и 1,48 µg/ml) и трипсин (0,336 µg/ml), 0.592 ug/mL и 0.723 ug/mL). Растежът на щамовете се изброява 4 часа след инкубиране при 37 ° С. Този анализ се извършва в три екземпляра.

Тест за антимикробна активност.

За да се оцени антимикробната способност на изолатите, беше направен тест за агар на място [22]. Патогенните бактерии, използвани в това проучване, са Escherichia coli ATCC 8739, Staphyloccocus aureus ATCC 6538P, Micrococcus luteus MTCC 2470, Salmonella typhi ATCC 786, Pseudominas aeruginosa ATCC 25619 и Staphylococcus epidermidis ATCC12228. Накратко, 2.5 ul от прясна LAB култура бяха забелязани върху MRS агарови плаки и инкубирани при 37 ° С за 24 часа. След това повърхността на агара се покрива с 15 ml LB агар, инокулиран с патогенните щамове при концентрация 10 6 CFU/ml. След това плаките се инкубират при 37 ° С. Инхибирането на растежа се открива след 24 часа чрез измерване на диаметрите на зоните на инхибиране. Тестът е извършен в три екземпляра.

Измерване на производството на H2O2.

Прясно култивираните клетки от LAB щамове се събират чрез центрофугиране при 10 000 rpm в продължение на 10 минути при 0 ° С. 2 g от клетъчната утайка се ресуспендират в 20 ml студен, стерилен фосфатен буфер (коригирано до рН 6,5). След това клетките се инкубират при 5 ° С за период от 5 дни при анаеробни условия. Измерванията на H2O2 бяха направени по методите на Вилегас и Гилиланд [24].

Способност на клетъчната адхезия.

Способността на адхезията на кандидат-щамове към човешки ентероцитоподобни Caco-2 клетки беше оценена по метода, описан по-горе [29]. Накратко, клетките бяха отгледани в минималната основна среда (DMEM) на Dulbecco (Invitrogen, Германия) със 100 U/mL пеницилин и 100 mg/mL стрептомицин. Преди тестовете за прилепване, Caco-2 клетки се култивират в 2 ml от средата без антибиотици в продължение на 10 дни. След стандартизиране на условията и приготвяне на монослой (1 х 105 клетки/ямка) от клетъчни линии, 1 ml от средата беше заменен с 1 ml LAB суспензия (10 8 CFU/ml в DMEM). След това инокулираните култури се инкубират в продължение на 3 часа при 37 ° С в 5% СО2. Инфектираните клетки се измиват 3 пъти със стерилен PBS (рН 7,8), фиксират се в продължение на 2 часа с 10% формалдехид, оцветяват се по Грам и се наблюдават микроскопски (увеличение 1500 пъти, с маслено потапяне). Бяха преброени прилепналите бактерии от 20 произволно избрани микроскопични полета. Всички проби бяха анализирани в три екземпляра.

Чувствителността на щамовете към антибиотиците.

Тестовете за възприемчивост на дискова дифузия бяха проведени съгласно стандартната процедура на Института за клинични и лабораторни стандарти (CLSI) [25]. Лабораторните щамове бяха инокулирани в MRS и инкубирани при 37 ° С за 24 часа. След това бульонът за култура се разрежда до концентрация 6 × 108 CFU/mL и се разпространява върху цялата повърхност на изсушена MRS агарова плака с помощта на стерилен памучен тампон. Антибиотични дискове (виж съдържанието на антибиотиците в табл. 3) бяха поставени на повърхността на всяка MRS плака. След инкубация в продължение на 48 часа при 37 ° С, се измерва диаметърът (в mm) на зоната на инхибиране около всеки диск, за да се класифицира антибиотичната чувствителност на всеки изолат. Всички проби бяха анализирани в три екземпляра.