Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Готфрид Шац Изследователски център, Молекулярна биология и биохимия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Институт по лабораторни животински науки, Университет по ветеринарна медицина, Виена, Австрия

Катедра по човешка генетика, Медицински център на Университета в Лайден, Лайден, Холандия

Готфрид Шац Изследователски център, Молекулярна биология и биохимия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Отдел по гастроентерология и хепатология, Медицински университет Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Адресирайте кореспонденцията и заявките за повторно отпечатване до:

Гюнтер Хеммерле, д-р, Институт по молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Хайнрихщрасе 31а, A ‐ 8010 Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Готфрид Шац Изследователски център, Молекулярна биология и биохимия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Институт по лабораторни животински науки, Университет по ветеринарна медицина, Виена, Австрия

Катедра по човешка генетика, Медицински център на Университета в Лайден, Лайден, Холандия

Готфрид Шац Изследователски център, Молекулярна биология и биохимия, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Отдел по гастроентерология и хепатология, Медицински университет Грац, Грац, Австрия

Диагностично-изследователски център за молекулярна биомедицина Институт по патология, Медицински университет в Грац, Грац, Австрия

Институт за молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Грац, Австрия

Адресирайте кореспонденцията и заявките за повторно отпечатване до:

Гюнтер Хеммерле, д-р, Институт по молекулярни биологични науки, Университет в Грац, Heinrichstrasse 31a, A ‐ 8010 Грац, Австрия

Резюме

Съкращения

Методи

Клониране и изразяване на Ces2c в COS ‐ 7 клетки

Пълнометражен Ces2c е клониран във pFLAG-CMV-5.1 вектор и е използван за преходна експресия в COS-7 клетки. За стабилна експресия в COS ‐ 7 клетки се генерира лентивирус чрез клониране на Ces2c в плазмида pLVX-IRES-Puro, последвано от събиране във вириони в човешки ембрионални бъбречни клетки. Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Анализи на активността на TGH и диглицерид хидролаза в клетъчни и тъканни лизати

Проведени са анализи на активността на TGH и диглицерид хидролаза (DGH), както е съобщено с някои незначителни модификации. 9 Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Проучвания за включване на FA и FAO в клетъчната култура

За измерване ex vivo FA метаболизъм, стабилно Ces2c трансдуцираните COS-7 клетки бяха инкубирани с радиомаркирана олеинова киселина (ОА) и гладувани в продължение на 4 часа. Измерванията на FAO бяха извършени в COS-7 клетки, стабилно свръхекспресиращи FLAG-маркирани Ces2c прилагане на радиомаркирана палмитинова киселина (PA), както е описано. 10 Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

РНК и протеинови методи

Тъканната РНК се екстрахира с помощта на реактив Trizol и се провежда количествена полимеразна верижна реакция в реално време чрез прилагане на системата за откриване на Applied Biosystems StepOnePlus (Фостър Сити, Калифорния). Грундовете са изброени в поддържаща таблица S2.

Анализи на Western Blot

Анализи на Western blot бяха извършени с използване или на клетъчни лизати от COS ‐ 7 или Expi293 клетки, или на чревни, чернодробни или Musculus (M.) квадрицепс тъканни лизати от Ces2c int мишки съгласно стандартни процедури.

Животни и диета

Генерират се трансгенни мишки, експресиращи миши Ces2c комплементарна ДНК (cDNA) под контрола на специфичния за червата 12.4-kb промотор на вилин. Подробности са предоставени в поддържащата информация. Беше потвърдено специфично без патогенно качество мишки в съответствие с настоящите препоръки на Федерацията за лабораторни животински асоциации. Животните са настанени в клетки с течности от Tecniplast тип 2 (Tecniplast, Hohenpeißenberg, Германия) при стандартни лабораторни условия (стайна температура, 21 ± 1 ° C [средно ± SEM]; относителна влажност, 45% -65%; фотопериод, 14L: 10D) и се доставя със стандартна лабораторна диета с чау (4,5% мазнини) или диета с високо съдържание на мазнини (HFD) (45% мазнини; ssniff Spezialdiäten GmbH, Soest, Германия) и чешмяна вода ad libitum. Освен ако не е посочено друго, са изследвани мъжки мишки на възраст от 12 до 16 седмици. В проучванията бяха използвани хемизиготни кученца и мишките бяха кръстосани поне пет пъти от C57BL/6N на фона на C57BL/6JRj. Тъканите и органите бяха събрани и незабавно замразени. Генетично модифициране, поддържане, боравене и събиране на тъкани от мишки е одобрено от австрийското федерално министерство за наука и изследвания и от комисията по етика на Университета в Грац и Университета по ветеринарна медицина Виена.

Химия на плазмата

За анализ на плазмените параметри животните бяха анестезирани за кратко и кръвта беше събрана от орбиталния сплит. Плазмените TG, свободните мастни киселини (FFA), общите фосфолипиди и общият холестерол се определят с помощта на търговски комплекти (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA; Merck, Darmstadt, Германия; Wako Chemicals, Neuss, Германия; DiaSys Diagnostics, Holzheim, Германия; Roche Diagnostics, Rotkreuz, Германия). Кръвната глюкоза се определя с помощта на глюкометър Wellion CALLA (Med Trust, Marz, Австрия), а плазмените нива на инсулин се измерват с помощта на миши инсулин ELISA Kit (Hölzel Diagnostika GmbH, Köln, Германия).

Определяне на чернодробни и чревни липиди

Чернодробните липиди се екстрахират съгласно метода на Folch et al. 11 и се измерва с търговски комплект (Thermo Fisher Scientific). Експлантите на чревната тъкан се извличат съгласно Matyash et al., 12 и се извършва целенасочен липидомичен анализ, като се използва анализ на масспектрометрия с течна хроматография с ултра-ефективност (Bruker, Billerica, MA). Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Постпрандиална секреция на липопротеини и хиломикрон

Клирънсът на липопротеините след хранене и скоростта на секреция на хиломикрон се определят, както е описано. 13 Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Глюкозна толерантност и усвояване на мазнини с храната

Тестовете за толерантност към глюкоза се провеждат при 6-часови гладни мишки. 14 Абсорбцията на мазнини по дължината на тънките черва се оценява, както е описано. 13

Метаболитен фенотип

Аклиматизираните мишки бяха настанени в лабораторна система за наблюдение на животни, което позволява непрекъснато измерване на двигателната активност, консумацията на кислород и елиминирането на въглеродния диоксид. Изчисляването на енергийните разходи, базирани на активност (AEE) и метаболизма в покой (RMR), беше извършено, както е описано от van Klinken et al. 15 Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Анализи на нивата на консумация на кислород

За да се изследват нивата на консумация на кислород (OCR), беше извършена респирометрия с висока разделителна способност с прясно приготвени чревни лизати на цялата тъкан. Подробна информация можете да намерите в поддържащата информация.

Абсорбция на мазнини, анализ на фекалиите и фекална продукция

Абсорбцията на мазнини се определя чрез метода на захароза полибехенат, както е описано. 16 Фекалната продукция е измерена на 5 последователни дни. За измерване на съдържанието на фекална енергия изпражненията на едноместни, хранени с HFD мишки бяха изгорени в адиабатен калориметър с кислородна бомба.

Статистически анализ

Статистическата значимост се определя от несдвоения студент т тест (двустранен) или анализ на ковариацията (ANCOVA). Груповите разлики бяха счетени за значими за *P

Резултати

Ces2c ефективно хидролизира TG и DG и насърчава FAO

предпазва

Ces2c int Мишки проявяват повишена чревна липолиза и окислително дишане

Ces2c int мишките са защитени от HFD-индуцирано затлъстяване

Чревни Ces2c Свръхекспресията предпазва мишките от HFD-индуцирана NAFLD и подобрява чувствителността на чернодробния инсулин

Ces2c int Мишки показват нормален прием на храна и леки промени в енергийните разходи за HFD

По-слабият фенотип, наблюдаван при Ces2c int мишки на HFD, може да се обясни с различни механизми, включително промени в приема на храна и/или разхода на енергия (EE). За справяне с последиците от чревни Ces2c свръхекспресия на енергийния катаболизъм на цялото тяло, настанихме мишки в метаболитни клетки. Консумацията на кислород и изходът на въглероден диоксид се измерват непрекъснато, за да се изчисли скоростта на дишане (RER). Не наблюдавахме значителни промени в средните стойности на общия и светлинно-фазовия RER, като стойностите при приблизително 0.85 показват изгарянето на смес от мазнини и въглехидрати. Интересното е, че RER е значително увеличен при мишки Ces2c int по време на тъмната фаза, което показва преминаване към използване на въглехидрати като окислително гориво (Фиг. 5А). Ежедневният прием на храна (подкрепящ фиг. S5A, ляв панел) или общият прием на храна, наблюдаван за период от 2 седмици на HFD (фиг. 5B, ляв панел), по същество е непроменен между Ces2c int мишки в сравнение с контролите. Нивата на активност също са сравними между групите (фиг. 5В, среден панел). Интересното е, че телесната температура е леко повишена при Ces2c int мишки (фиг. 5В, десен панел). Общият разход на енергия (TEE) е по-нисък при Ces2c int мишки в сравнение с контролите (P = 0,07) (фиг. 5С), което се дължи на по-нисък RMR (P int мишки (P

Ces2c int Мишки показват нормална липидна абсорбция, но промени в чревната липидна хомеостаза

Чревни Ces2c Свръхекспресията увеличава размера и изчистването на частиците от хиломикрон

Дискусия

Повечето TG се усвояват до 2-MG и се абсорбират в тънките черва 26, 27 за реестерификация и генериране на TG, които са опаковани или в цитозолни LDs, или върху apoB48 с помощта на Mttp. 5 Следователно ние предлагаме, че увеличеното луминално изобилие на Ces2c увеличава TG/DG липолизата в ER, като по този начин генерира FAs за окисление и MGs/DGs за повторна естерификация и TG генериране, което води до образуването на по-липидирани частици apoB48 (Фиг. 8), които се изчистват ефективно от циркулацията. Като алтернатива е възможно също така повишената TG/DG липолиза при ER да понижава пространствено нивата на TG за MTPP-медиирана апоВ48 липидация. Нелипидираният apoB48 е нестабилен и се разгражда по протеазомния път. 28 Следователно, по-малко първични частици могат да придобият повече TG (и естери на холестерола), което води до увеличаване на размера на частиците и ефективно изчистване от циркулацията.

Заедно това проучване изяснява чревните Ces2c/CES2 като цел за противодействие на развитието на NAFLD и затлъстяването.

Потенциален конфликт на интереси

Д-р Лакнър получи безвъзмездни средства от Галмед.

Благодарности

Благодарим на Astrid Steiner и Birgit Juritsch за грижите и генотипирането на животните, Silvia Schauer за хистологичния анализ и д-р Susanne Grond, Anton Ibovnik и Tina Bernthaler за техническа помощ. Също така благодарим на д-р Сабрина Ридл и д-р Дагмар Цвайтик за техническа поддръжка с анализите на зетазатора и на Вернер Де Цеко за техническа поддръжка при измерванията на съдържанието на фекална енергия.

Моля, обърнете внимание: Издателят не носи отговорност за съдържанието или функционалността на която и да е поддържаща информация, предоставена от авторите. Всички заявки (различни от липсващо съдържание) трябва да бъдат насочени към съответния автор на статията.

  • 1 Klop B, Elte JWF, Cabezas MC. Дислипидемия при затлъстяване: механизми и потенциални цели . Хранителни вещества 2013; 5: 1218 - 1240 .

Имената на авторите с удебелен шрифт обозначават споделено съ-първо авторство.