Ирка М Ределспергер

1 Триинституционална програма за обучение по лабораторна медицина и наука за животните, Център за раково заболяване Memorial Sloan Kettering, Медицински колеж Weill Cornell и Университет Рокфелер

фуражи

Тони Талдън

2 Мемориален център за рак на Sloan Kettering

Елин Р Ридел

2 Мемориален център за рак на Sloan Kettering

Мишел Л. Леферд

1 Триинституционална програма за обучение по лабораторна медицина и наука за животните, Център за раково заболяване Memorial Sloan Kettering, Медицински колеж Weill Cornell и Университет Рокфелер

2 Мемориален център за рак на Sloan Kettering

3 Университетът Рокфелер и

4 Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк

Нийл S Липман

1 Триинституционална програма за обучение по лабораторна медицина и наука за животните, Център за раково заболяване Memorial Sloan Kettering, Медицински колеж Weill Cornell и Университет Рокфелер

2 Мемориален център за рак на Sloan Kettering

4 Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк

Феликс Р Вълк

1 Триинституционална програма за обучение по лабораторна медицина и наука за животните, Център за рак на Memorial Sloan Kettering, Медицински колеж Weill Cornell и Университет Рокфелер

2 Мемориален център за рак на Sloan Kettering

4 Медицински колеж Weill Cornell, Ню Йорк, Ню Йорк

Резюме

Тетрациклиновите (тет) -зависими регулаторни системи често се използват при генетично модифицирани мишки от средата на 90-те години на миналия век за изследване на функцията на гени, които не могат да бъдат изследвани чрез инактивация на гени или експресия на трансген. 18 Тези системи са обстойно прегледани. 24, 39, 40 Доксициклинът е за предпочитане пред тетрациклин като индуктор в тези системи поради високата сила на доксициклин, превъзходното проникване в тъканите и широкото му разпространение. 23, 3 Обикновено се прилага във фуражи или питейна вода. 39 Въпреки широкото използване на индуцируеми доксициклин конструкции, не са публикувани нито доказана доза доксициклин за повечето от условните модели на мутантни мишки, нито стандарти за неговото съхранение и употреба.

Някои източници съобщават, че най-често използваната концентрация на доксициклин във фуражите е 200 ppm на база сухо вещество. 39, 40 Въпреки това, въз основа на нашия опит и посочените в литературата концентрации, 625 ppm се използват поне толкова често, ако не и по-често. 31, 37, 41 Прилагат се високи дози, за да се осигури максимална индукция. Въпреки че високите дози могат да бъдат оправдани за разпределение в тъкани с лошо проникване (например в мозъка) 26, 31, доксициклинът може лесно да проникне и да достигне адекватни концентрации в повечето тъкани. 1, 38, 47 Например, доксициклин започва да инхибира клетъчната пролиферация и образуването на колонии в 2 клетъчни линии на бозайници при 0,2 и 20 µg/mL. 17

Доксициклин има биологични ефекти, които надхвърлят неговата антимикробна активност. 15, 33, 46 Вероятно е, че някои от често използваните концентрации на доксициклин, комбинирани с продължителността на приложението му, могат да имат неочаквани биологични ефекти in vivo. Даван в доза от приблизително 15 mg/kg дневно за 21 дни, доксициклин може да инхибира пролиферацията на туморни клетки, 15 и дози до 50 mg/kg дневно (по-ниска доза от тази, постигната при използване на 625 ppm във фуража или 2 mg/мл в питейна вода) може да намали размера на коремните аневризми при мишки. 33 Тези открития се дължат на способността на доксициклин да инхибира матричните металопротеинази. 46

Кривите доза-отговор, публикувани за няколко специфични тетрациклинови транзактиватори (tTA, ‘tet-off’) мутанти, показват, че минималната ефективна доза за тези конструкции е значително по-ниска (20 до 25 µg/ml в питейна вода) от използваните в момента. 10, 22 За да тестваме хипотезата, че дозите на доксициклин, по-ниски от използваните понастоящем високи дози (2 mg/ml в питейна вода), могат ефективно да задействат тет-индуцируеми системи, използвахме 2 различни условни миши мутанти, всеки от които има различен промотор и трансактиватор ( R26-rtTA /TG-Ren.713 и R26-CAGS-rtTA3/TG-Ren.713), за да се определи минималната доза доксициклин, необходима за генно активиране. И двете мутантни линии включват система за обратен тетрациклинов трансактиватор (rtTA, ‘tet-on’), които са по-често срещани от системите tet-on и са далеч по-малко чувствителни към индукция на доксициклин. 3, 10, 14, 17, 22, 40

В допълнение към разликите в приложената доза, начинът, по който се обработва доксициклин по отношение на съхранението и заместването, варира значително. Въпреки че различни източници предлагат да се замества водата, съдържаща доксициклин, на всеки 3 дни, 10, 19, 22, няколко изследователи съобщават за смяна на водата на всеки 48 часа, 8 и други заменят водата седмично. 29 В допълнение, често се препоръчва да се заместват фуражите, лекувани с доксициклин, поне седмично. 8 Изследователите често използват това изискване, за да оправдаят поддържането на ниски нива на вода и фураж, за да минимизират отпадъците, налагайки повишена бдителност от страна на грижите за животните и разследващия персонал, за да се гарантира, че животните винаги имат достъп до достатъчно храна и вода. Необходими са препоръки, основани на доказателства, за да се сведе до минимум количеството храна и вода, загубени по време на тези експерименти.

Тетрациклините абсорбират UVA светлината и се считат за светочувствителни и нестабилни във вода. 11, 46 Тези характеристики водят до необходимостта от поставяне на разтвори на доксициклин в защитени от светлина (оцветени бутилки) и подмяна на водата на всеки няколко дни. 3, 39 Едно проучване установи, че доксициклинът остава стабилен във вода с температура 37 ° C в оцветени бутилки в продължение на 1 седмица. 20 Съобщава се, че подкисляването на водата значително подобрява стабилността на доксициклин. 27 В светлината на тези открития ние се опитахме да изследваме стабилността на доксициклин в пречистена с обратна осмоза (RO) вода, която е подкиселена или некиселена при стайна температура (23 ° C; температурата, при която водата обикновено се подава на мишки) над 14-дневен период. Избрахме тази времева рамка в светлината на неотдавнашната тенденция към подмяна на бутилки с вода на всеки 2 седмици в няколко институции, включително нашата.

Доказано е, че доксициклинът е широко разпространен в тъканите след перорално приложение при различни видове, 1, 2, 38 и има някои данни относно плазмените концентрации на доксициклин след приложение на мишки във вода, 27 но няма съобщени проучвания върху плазмените концентрации, когато лекарството се предоставя на мишки в храната. Тъй като концентрациите на доксициклин в предлаганите на пазара фуражи не са разработени за постигане на дозите, които обикновено се прилагат във вода, дали двата метода на приложение са сравними, не е известно. Обикновено мишките консумират средно 4,5 g фураж и 6 ml вода дневно. 4 Използвайки тази информация, ние се опитахме да осигурим доксициклин във вода по начин, който дава същата доза като 200- и 625-ppm дози във фуража и впоследствие измерихме плазмената концентрация на доксициклин, постигната при мишки.

Материали и методи

Животни.

Употребата на животни е одобрена от IACUC на Центъра за рак на Memorial Sloan Kettering, където програмата за грижи и употреба на животните е акредитирана от AAALAC и всички животни се поддържат и използват в съответствие с препоръките, предоставени в Ръководството. 21.

Вземане на кръв.

Кръв се събираше по едно и също време всеки ден. Всички кръвни проби бяха събрани от мишки в ограничители чрез венепункция на страничната вена на опашката след затопляне под топлинна лампа за 2 до 5 минути. Максимален обем от 100 μL кръв се събира в конична епруветка, съдържаща EDTA (Microvette 100, Kent Scientific, Torrington, CT).

Съдържащи доксициклин фуражи и вода.

Предлаганият в търговската мрежа γ-облъчен фураж за гризачи, съдържащ доксициклин, закупен от 2 производители (Harlan Teklad, Indianapolis, IN и PMI), е получен в рамките на 30 дни след смилането. Фураж, съдържащ 625 ppm доксициклин (каталожен номер TD.01306, TestDiet 5053, съдържащ 625 ppm доксициклин, PMI) бяха използвани за оценка на стабилността на доксициклин след смилане, облъчване, транспортиране и съхранение. Емисия, съдържаща 625 ppm (TD.01306) и 200 ppm (TD.00502, Harlan Teklad) доксициклин, бяха използвани за оценка на генната експресия и плазмената концентрация в 2 генно инженерни индуцируеми миши щама.

За оценка на стабилността на доксициклин във вода, подготвихме 500-милилитров разтвор, съдържащ 2 mg/ml доксициклин (D9891, Sigma Aldrich, St Louis, MO) и 5% захароза (S9378, Sigma Aldrich), като използвахме RO вода (pH 6,0 ) или подкиселена с HCl RO вода (рН 2.7), поставени 450 ml в зелени или неоцветени, 473 ml, полисулфонови бутилки (Thoren Caging Systems) и анализирани, както е описано. За проучвания, оценяващи ефективни дози, към подкислената RO вода се добавят различни концентрации на доксициклин и захароза, за да се постигне доксициклин: концентрации на захароза от 2 mg/ml: 5%, 467 µg/ml: 2%, 150 µg/ml: 1% и 25 µg/ml: 0,23%.

Определяне на концентрацията на доксициклин.

Пелетите се смилат индивидуално в кафемелачка (Fresh Grind, Hamilton Beach, Southern Pines, NC). Приблизително 25 mg смлени пелети се поставят в 15-милилитрова епруветка; Прибавят се 0,5 ml смес от 75% вода + 25% ацетонитрил + 0,1% мравчена киселина и сместа се завихря за 5 минути и след това се обработва с ултразвук за допълнителни 40 минути. Епруветката се центрофугира за 5 минути при 180 х g супернатантата се прехвърля в нова 15-милилитрова епруветка и част се филтрира (0,45 µm; Sun SRI, Rockwood, TN) в друга епруветка. 50-μL аликвотна част се прехвърля в ямката на 96-ямкова плака за анализ чрез HPLC-тандемна масспектрометрия (LC-MS/MS).

Плазма.

Плазма (50 uL) се добавя към 1,5-милилитрова епруветка за микроцентрифугиране (Eppendorf Safe-Lock, USA Scientific, Ocala, FL), последвана от 250 uL ацетонитрил. Пробата се завихря за около 45 s, центрофугира се за 5 минути при 19,445 х g и супернатантата се прехвърля в друга епруветка за микроцентрифугиране. Пробата се изпарява на центробежен изпарител (GeneVac, Stone Ridge, NJ) и остатъкът се разтваря в 100 uL разтворител (75% H2O + 25% ацетонитрил + 0,1% мравчена киселина). Разтворът се завихря за около 15 s и се центрофугира за 5 минути при 19,445 х g; 50 ul от супернатантата се прехвърлят в ямката на 96-ямкова плака за анализ чрез LC-MS/MS.

Вода.

Всяка водна проба (50 µL) се добавя към 950 µL смес от 75% вода + 25% ацетонитрил + 0,1% мравчена киселина (разредител) в епруветка за микрофуги и се завихря за 10 s; 20 µL от тази смес се добавят към 980 µL разредител и се завихря за 10 секунди; 50 uL от крайната смес се прехвърлят в ямката на 96-ямкова плака за анализ чрез LC-MS/MS.

Анализ на доксициклин.

Концентрациите на доксициклин във фуражи, вода и плазма се определят чрез използване на LC-MS/MS (модел 6410 LC-MS/MS система, Agilent Technologies, Санта Клара, Калифорния). Анализът се основава на доксициклин (а не на неговата хиклатна сол; 1 mg доксициклин е еквивалентно на 1,154 mg доксициклин хиклат). Анализът беше извършен в режим на многократна реакция за наблюдение, използвайки йонизация с електроспрей с положителни йони. HPLC разделянето се провежда на 4,6 mm × 50 mm, 5 µm колона (Zorbax Eclipse XDB-C18 колона, Agilent Technologies) и анализираният продукт се елуира при изократични условия (75% H2O + 0,1% HCOOH: 25% CH3CN) за 5 минути при скорост на потока 0,5 mL/min. Стандартите на доксициклин хиклат бяха използвани за генериране на стандартна крива с граница на откриване 50 pg/ml за всички видове проби.

Проточна цитометрия.

Експериментален план.

Стабилност на доксициклин във вода.

За да се оцени степента, до която условията на осветление в помещението (750 ± 110 lx по време на включени светлини; 12: 12-часов светлина: тъмен цикъл) влияят на доксициклин в бутилки с вода в клетките на мишки, проби бяха събрани от полисулфонови бутилки със зелено оцветяване и стандартни, неоцветени полисулфонови бутилки (Thoren Caging Systems). На ден 0 се приготвя вода, съдържаща доксициклин, като се използва или RO, или подкиселена RO вода, както е описано. Всеки разтвор беше разделен между 3 оцветени и 3 неоцветени бутилки. От всяка бутилка се взема проба от 1 ml преди поставянето й в клетка. След това се взема проба от 1 ml вода от всяка бутилка 7 и 14 d след поставянето или по-рано (ако водата стане негодна за консумация; например наличие на плесен или утайки). Водните проби се съхраняват при –80 ° C, докато се анализират.

Стабилност на доксициклин във фуражите по време на смилане и след съхранение.