Резюме

Заден план

Въпреки доказателствата, свързващи затлъстяването с нарушената имунна функция, малко се знае за специфичните механизми. Поради появяващите се доказателства, че имунните отговори са епигенетично регулирани, ние предположихме, че промените в метилирането на ДНК участват в имунната дисфункция, предизвикана от затлъстяването, и имаме за цел да идентифицираме тези промени.

Метод

Проведохме анализ на метилиране с широк геном на седем случая със затлъстяване и седем слаби контроли на възраст от 14 до 18 години от крайните краища на разпределението на затлъстяването и извършихме допълнително валидиране на шест CpG места от шест гена в 46 случая със затлъстяване и 46 постни контроли на възраст от 14 до 30 години години.

Резултати

В сравнение с постните контроли, наблюдавахме едно CpG място в гена UBASH3A, показващо по-високи нива на метилиране, и едно CpG място в гена TRIM3, показващо по-ниски нива на метилиране в случаите на затлъстяване и в двата етапа на целия геном (P = 5 × 10 -6 и P = 2 × 10 -5 за UBASH3A и TRIM3 гена съответно) и стъпката на валидиране (P = 0,008 и P = 0,001 за UBASH3A и TRIM3 гена съответно).

Заключения

Нашите резултати предоставят доказателства, че затлъстяването е свързано с промени в метилирането в ДНК на левкоцитите в кръвта. По-нататъшни проучвания са оправдани, за да се определи причинно-следствената посока на тази връзка, както и дали такива промени в метилирането могат да доведат до имунна дисфункция.

Заден план

Затлъстяването е епидемията на нашето време, с рязко и постоянно нарастващи темпове [1, 2]. Основните неблагоприятни последици от затлъстяването, включително диабет тип 2, атеросклероза и есенциална хипертония, когато се съберат, отчитат голям брой смъртни случаи, свързани с болести [3, 4]. Ако към този брой се добавят случаите на рак, свързани със затлъстяването, смъртността, свързана със затлъстяването, далеч надхвърля тази при други често срещани заболявания [5]. Последното показва спешната необходимост от разработване на нови ефективни терапевтични методи за това състояние.

Общото в патогенезата на съпътстващите заболявания на затлъстяването е наличието на активен, нискостепенен възпалителен процес [6]. Въпреки доказателствата, свързващи затлъстяването с промени в възпалителния отговор, малко се знае за специфичните ефекти на затлъстяването върху имунната система. Напоследък се наблюдава по-голяма роля на епигенетиката, мейотично и митотично наследствени промени в генната експресия, които не са кодирани в самата ДНК последователност, в имунните и възпалителни отговори [7–9]. Следователно, ние предполагаме, че промените в метилирането на ДНК играят роля в имунната дисфункция, предизвикана от затлъстяването. Целта на това проучване беше да се охарактеризира профилът на метилиране на ДНК в левкоцитите на периферната кръв при затлъстели в сравнение със слаби субекти, използвайки геномен подход. Идентифицирането на промените в метилирането в специфични гени ще осигури важни цели за по-нататъшно проучване на механизмите на ефекта на затлъстяването върху имунната система и потенциала за разработване на нови терапии за лечение на множество съпътстващи заболявания при затлъстяване.

Методи

Субекти

Анализът на метилирането с широк геном е проведен при седем затлъстели и седем подбрани възрастови контроли. Тези 14 субекта бяха идентифицирани от участниците (n = 534) в проучването за начина на живот, затлъстяването и сърдечно-съдовото здраве в младежта (LACHY), като се използват следните критерии за включване: (1) афроамерикански произход (AA); (2) мъжки; (3) наличието на левкоцитна ДНК; (4) случаи на затлъстяване с индекс на телесна маса (ИТМ) ≥ 99-и персентил за възраст и пол и слаби контроли с ИТМ ≤ 10-ти персентил за възраст и пол. Проучването LACHY се състоеше от приблизително равен брой юноши от АА и Европа от Америка (ЕА) на възраст от 14 до 18 години от двата пола, наети от гимназии в района на Августа, Джорджия [10].

За четирите кохорти самоидентифицирането чрез самоотчети на всеки субект или от родител, ако субектът е бил на възраст под 18 години, се използва за класифициране на етническата принадлежност съгласно предварително описаните критерии [14]. Субектите във всичките четири проучвания са били откровено здрави, без никакви остри или хронични заболявания въз основа на родителски доклади и не са били на антихипертензивни, понижаващи липидите, антидиабетни и противовъзпалителни лекарства [10–13]. Съветът за преглед на институциите в Медицинския колеж в Джорджия одобри проучванията. Получено е информирано съгласие от всички субекти и от родителите, ако субектите са на възраст под 18 години.

Измервания

За всичките четири кохорти височината и теглото бяха измерени по стандартни методи, като се използва съответно монтиран на стената стадиометър и везна. ИТМ се изчислява като тегло/височина 2. Систоличният BP (SBP) и диастоличният BP (DBP) се измерват с монитори Dinamap, като се използва подходящ размер маншет за BP, поставен върху дясната ръка на субекта. BP измерванията са взети на 11, 13 и 15 минути, по време на 15-минутен период на релаксация в легнало положение. Средната стойност от последните две отчитания е използвана за представяне на стойностите на SBP и DBP [10–13].

Взети са проби от периферна кръв на гладно в кохортата LACHY и проби от периферна кръв на гладно в останалите три кохорти. Пробите от козината и плазмата се разделят и се съхраняват при -80 ° C. ДНК беше извлечена от козината. В кохортата на LACHY нивата на глюкозата на гладно бяха измервани с помощта на системата Ektachem DT II (Johnson and Johnson Clinical Diagnostics, Rochester, NY, USA) и инсулинът на гладно беше изследван в два екземпляра чрез специфичен радиоимуноанализ (Linco Research, Inc., St Charles, MO, САЩ) [10]. QUICKI (количествен индекс за проверка на инсулиновата чувствителност) беше изчислен, за да индексира инсулиновата чувствителност, използвайки следната формула: 1/[log (инсулин на гладно, μU/ml) + log (глюкоза на гладно, mg/dl)]. От скрининговата проба, която включва седемте случая със затлъстяване и седем постни контроли, избрани от кохортата LACHY, нивата на глюкоза и инсулин на гладно не са налични за един случай и една контрола.

Чип за метилиране с широк геном

Използва се BeadChip на HumanMethylation27 от Illumina (Illumina, Сан Диего, Калифорния, САЩ). Този чип може количествено да измери 27 000 CpG сайтове, обхващайки над 14 000 добре анотирани гени при единична CpG резолюция. Всеки чип може да побере 12 проби. След третиране с бисулфит, 200 ng от преобразуваната ДНК се усилва с цял геном (WGA) и се ензимно фрагментира. Преобразуваните от бисулфит WGA-ДНК проби се пречистват и се нанасят върху BeadChips. Обработката на изображенията и извличането на данни за интензивността бяха извършени съгласно инструкциите на Illumina http://www.illumina.com/products/infinium_humanmethylation27_beadchip_kits.ilmn. Всяка точка за данни за метилиране е представена от флуоресцентни сигнали от метилирани и неметилирани алели. ДНК метилиращите бета стойности са непрекъснати променливи между 0 (напълно неметилирани) и 1 (напълно метилирани), представляващи съотношението на интензивността на типа метилирани зърна към комбинирания интензитет на локусите. Първоначалната обработка на масива и контрол на качеството бяха извършени със софтуера BeadStudio. Данните за микрочипове, обсъдени в тази статия, са депозирани в Gene Expression Omnibus на NCBI и са достъпни чрез GEO сериен номер за присъединяване GSE25301 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE25301.

Пиросеквенция

Нивата на метилиране на избраните шест места на CpG от шестте гена в кохортата за репликация се определят чрез технология за пиросеквениране, бърз и силен метод за количествен анализ на метилиране. След третиране с бисулфит, 10 ng от преобразуваната ДНК се използва в PCR реакция за амплифициране на целевата област. Един от PCR праймерите е белязан с биотин. Едноверижните биотинилирани PCR продукти бяха подготвени за секвениране с помощта на Pyrosequencing Vacuum Prep Tool, съгласно инструкциите на производителя. Продуктите за PCR (всеки 10 μl) бяха секвенирани чрез система за пиросеквениране PSQ96 HS (Pyrosequencing-Qiagen), следвайки инструкциите на производителя. Състоянието на метилиране на всеки локус се анализира индивидуално като T/C SNP, използвайки софтуера QCpG (Biotage, Kungsgatan, Швеция). PCR праймери и секвениращи праймери за тези шест гена са изброени в Допълнителен файл 1. Всички проби са анализирани в същия цикъл и в произволна последователност.

Статистически анализ

За анализа на метилирането с широк геном беше използван пакетът Limma [15] за анализ на всяко CpG място за диференциално метилиране между затлъстели и слаби субекти. CpG местата на х и Y хромозомите бяха изключени от анализа. На всеки CpG сайт беше зададено сурово P-стойност въз основа на модерирана t статистика. За да коригирате за многократно тестване, набор от сурови P-стойностите са преобразувани в проценти на фалшиви открития (FDR) според Бенджамини и Хохберг [16]. За шестте CpG сайтове в кохортата за репликация, Student's т-тестът е използван за изследване дали техните нива на метилиране се различават между затлъстелите и слабите групи. По-нататък се използва линейна регресия за коригиране на потенциалния ефект на възрастта върху нивата на метилиране. Комбинирахме широк геном и стъпките за репликация за тези шест CpG места, използвайки метода на мета-анализ на базата на претеглена оценка на z, реализиран в пакета METAL [17]. Преди анализ, нивата на метилиране на CpG сайтовете в кохортата на репликация се трансформират в логаритъма или се преобразуват в квадратен корен, за да се получи по-добро сближаване на нормалното разпределение. Предварителни анализи, t-тестове и регресионни анализи бяха направени с помощта на STATA 8 (StataCorp, College Station, Тексас, САЩ).

Анализът на генната онтология е извършен с инструмента FatiGO [18]. FatiGO взема два списъка с гени и ги преобразува в два списъка с GO термини. След това се използва точен тест на Фишър за 2 × 2 непредвидени таблици, за да се провери за значително свръхпредставяне на GO термини в един от наборите по отношение на другия. Корекция на множество тестове (индексирана чрез коригирана P-стойности) за отчитане на множествената тествана хипотеза (по една за всеки GO термин) се прилага за намаляване на фалшивите положителни резултати. Тъй като най-малко две CpG места бяха включени за по-голямата част от гените в този чип с широк геном, ние избрахме сайтовете CpG с най-ниска p стойност, за да представим този ген.

Резултати

затлъстяването

Вулканичен сюжет, показващ суров P- стойности спрямо средна разлика в метилирането между случаите на затлъстяване и постните контроли.

Въпреки че пиросеквениращият анализ е проектиран да насочва едно специфично CpG място за всеки ген, някои от анализите обхващат няколко околни CpG места. Резултатите от тези CpG сайтове също са изброени в Таблица 4. Корелацията в пробите между множеството CpG сайтове, измерени в гена, е посочена в Допълнителен файл 3.

Анализът на генната онтология беше проведен, за да се провери дали някои често срещани функционални тенденции в молекулярните функции и биологичните процеси са свързани с гените, показващи разлики между случаите на затлъстяване и слабите контроли в генетичния чип. Включихме тези гени със суров P ≤ 0,01 към първия списък (n = 298) и включва всички останали гени във втория списък. Както се очакваше от пилотно проучване при 14 субекта, не наблюдавахме нито една GO категория да оцелее при множество тестове. Таблица 5 изброява категориите GO със сурови P-стойност по-малка от 0,05. Интересното е, че наблюдавахме обогатени функционални процеси, които са потенциално важни за възпалителния отговор с имунен отговор (GO: 0006955), клетъчно активиране (GO: 0001775), производство на цитокини (GO: 0001816), отговор на биотичен стимул (GO: 0009607) и антиген обвързване (GO: 0003823) сред най-добрите GO категории. Резултатите подкрепят, че затлъстяването може да доведе до промени в метилирането в гените, участващи в възпалителните пътища.

Дискусия

В това проучване имахме за цел да идентифицираме свързаните със затлъстяването промени в метилирането в левкоцитите на периферната кръв, използвайки геномен подход при младежи и млади възрастни, които нямат съпътстващи заболявания на затлъстяването. Основните констатации от това проучване са повишени нива на метилиране на едно място на CpG в UBASH3A ген и намалено ниво на метилиране на едно място на CpG в TRIM3 ген при затлъстели субекти в сравнение с постно контроли.

Има няколко силни страни на това проучване. Първо, ние избрахме случаи със затлъстяване и контроли с екстремни фенотипове, което максимизира силата да правите открития. Второ, фокусирахме се върху младежите и младите възрастни с очевидното предимство, че резултатите не са объркани от съпътстващите заболявания на затлъстяването или употребата на лекарства, и двете от които са много чести при възрастни субекти със затлъстяване. На трето място, беше използван подход, който не включва хипотези и геном. Този подход замества ограниченията, наложени от проучванията за метилиране на кандидат-ген и позволява безпристрастно търсене на целия геном.

Заключение

В това проучване идентифицирахме няколко възпроизводими промени в ДНК метилирането на периферни кръвни левкоцити между случаите на затлъстяване и постните контроли. Това проучване предоставя доказателства, че затлъстяването е свързано с промени в метилирането в ДНК на левкоцитите в кръвта. По-нататъшни проучвания са оправдани, за да се определи причинно-следствената посока на тази връзка, както и дали такива промени в метилирането могат да доведат до имунна дисфункция. Такива проучвания ще имат способността да идентифицират нов поглед върху етиологията на заболяванията и да предоставят нови цели за профилактика на заболявания, свързани със затлъстяването, като сърдечно-съдови заболявания и диабет тип 2.