Резюме

Предистория и цели

Анаболните стероиди са синтетични производни на тестостерона, модифицирани, за да подобрят неговите анаболни действия (насърчаване на протеиновия синтез и мускулния растеж). Те имат многобройни странични ефекти и са в списъка на Международния олимпийски комитет със забранени вещества. Газовата хроматография-масова спектрометрия позволява идентифициране и характеризиране на стероиди и техните метаболити в урината, но може да не прави разлика между фармацевтичен и естествен тестостерон. Непреки методи за откриване на допинг включват определяне на съотношението тестостерон/епитестостерон глюкуронид с подходящи гранични стойности. Пряко доказателство може да бъде получено с метод, основан на определяне на съотношението въглероден изотоп на уринарните стероиди. Тази статия има за цел да даде преглед на употребата на анаболно-андрогенни стероиди в спорта и методите, използвани в антидопинговите лаборатории за тяхното откриване в урината, със специален акцент върху допинга с тестостерон.

Методи

Преглед на най-новата литература за тестване на анаболни стероиди, спортна употреба и неблагоприятни ефекти на анаболно-андрогенните стероиди.

Резултати

Описани са процедурите, използвани за откриване на допинг с ендогенни стероиди. Световната антидопингова агенция предостави ръководство през август 2004 г., за да гарантира, че лабораториите могат да отчитат по еднакъв начин наличието на анормални профили на уринарни стероиди, получени от прилагането на тестостерон или неговите прекурсори, андростендиол, андростендион, дехидроепиандростерон или тестостерон метаболит, дихидротестостерон или маскиращо средство, епитестостерон.

Заключения

Разработената технология за откриване на тестостерон в проби от урина изглежда подходяща, когато веществото е приложено интрамускулно. Пероралното приложение води до бърза фармакокинетика, така че пробите от урината трябва да се вземат в първите часове след приема. Поради това е необходимо да се намерят специфични биомаркери в урината или плазмата, за да се даде възможност за откриване на дългосрочно перорално приложение на тестостерон.

Анаболните стероиди са химични, синтетични производни на тестостерон, модифицирани, за да подобрят анаболните, а не андрогенните действия на хормона (фиг. 1 1). 1 Тестостеронът е стероиден хормон, синтезиран в човешкото тяло от холестерол. 2 Той изпълнява различни функции на различни етапи от живота. По време на ембрионалния живот андрогенното действие е от основно значение за развитието на мъжкия фенотип. В пубертета хормонът е отговорен за вторичните сексуални характеристики, които превръщат момчетата в мъже. Тестостеронът регулира много физиологични процеси при възрастни мъже, включително метаболизма на мускулните протеини, сексуалните и когнитивните функции, еритропоезата, плазмените нива на липидите и костния метаболизъм. 3

допинг

Фигура 1 Молекулярна структура на тестостерона.

Фармацевтично действие на анаболните стероиди

Скоро след изолирането на тестостерона през 1935 г. се установява, че той е практически неактивен, когато се приема през устата. След перорално поглъщане тестостеронът се абсорбира от тънките черва и преминава през порталната вена към черния дроб, където бързо се метаболизира, най-вече до неактивни съединения. 4, 5 Откриването на тестостерон доведе до синтеза на анаболни стероиди. Химическите модификации на тестостерона са били полезни фармакологично за промяна на относителната анаболно-андрогенна сила, забавяне на скоростта на инактивиране и промяна на модела на метаболизма. 6 Повечето перорални анаболно-андрогенни стероиди са 17α-алкилирани производни на тестостерона, които са относително устойчиви на чернодробно разграждане. Естерификацията на 17β-хидроксилната група прави молекулата по-разтворима в липидни везикули, използвани за инжектиране и по този начин забавя освобождаването на инжектирания стероид в циркулацията. Често използваните производни на 17α-алкил и 17β-естер са показани на фиг.22 .

Фигура 2 Анаболно-андрогенни стероиди: молекулярна структура на обичайните производни на 17α-алкил и 17β-естер.

Андрогенните и анаболните ефекти на анаболно-андрогенните стероиди произхождат от активирането на андрогенните рецептори. Разграничението между тези биологични ефекти зависи от органите и целевите тъкани. 7 Дихидротестостеронът е отговорен за андрогенния ефект. Този стероид е по-мощен от тестостерона поради повишен афинитет към андрогенния рецептор. Образува се от преобразуване на тестостерон от 5α-редуктазния ензим. 6 Активността на този ензим е важна в тестисите, кожата, простатата, червата, мозъка, костите и мастните тъкани. Следователно андрогенните ефекти на анаболно-андрогенните стероиди преобладават в тези органи. Анаболните ефекти ще се отнасят до органи като мускули, кости, сърце и бъбреци. Тези органи притежават слаба 5α-редуктазна активност и по този начин анаболните андрогенни стероиди, особено тестостеронът, индуцират протеинов синтез, развитие на мускулни влакна, еритропоеза и стимулиране и инхибиране на костния растеж. В допълнение, анаболните стероиди изместват глюкокортикоидите от глюкокортикоидните рецептори и инхибират катаболизма на мускулните протеини, което води като цяло до анаболен ефект или ефект на изграждане на мускулите. 9

Терапевтични и неблагоприятни ефекти на анаболно-андрогенните стероиди

Редица клинични проучвания, използващи различни експериментални проекти, показват, че мощните анаболни ефекти на анаболно-андрогенните стероиди имат положителни ползи за различни популации пациенти. Физиологичните заместителни дози тестостерон са използвани терапевтично за стимулиране на сексуалното развитие в случаи на забавен пубертет и в случаите, когато тестисите са били отстранени хирургически, било поради физическо нараняване или поради тумор на тестисите. Основната клинична употреба на анаболните стероиди е да инхибира загубата на протеин и да подпомогне регенерацията на мускулите след тежка операция. 10

Тъй като анаболно-андрогенните стероиди имат ефекти в няколко органични системи, могат да се наблюдават множество странични ефекти. 11, 12 Честотата на поява и тежестта на страничните ефекти са доста променливи и зависят от множество фактори като вида на лекарството, дозировката, продължителността на употреба и индивидуалната чувствителност на отговора. Потенциалните неблагоприятни ефекти на анаболно-андрогенните стероиди могат да бъдат разделени на следните категории: сърдечно-съдови, чернодробни, ендокринни/репродуктивни, психологични и сухожилни увреждания. 13, 14

Използване на анаболно-андрогенни стероиди от спортисти

Информацията за дозите и начините на приложение на анаболно-андрогенни стероиди, използвани от спортисти за повишаване на техните постижения, е сравнително оскъдна. 13 Известно е, че културистите следват типичен модел, наречен „подреждане“, основан на прилагане на няколко орални и инжекционни анаболно-андрогенни стероиди по време на цикли с продължителност 4–12 седмици. Предимството на тази практика е демонстрирано наскоро. 12 Дозировките на лекарството варират от 250 mg до 3500 mg на седмица и следователно са до 40 пъти препоръчителната терапевтична доза. 14 Въпреки това, някои проучвания описват ефекта от практиката на полифармацията при терапевтични дози при щангистите, 15 и атлети за издръжливост и спринт. 16.

Тестване на анаболни стероиди

Заден план

Медицинските комисии на големите международни спортни федерации и на Международния олимпийски комитет (МОК) са загрижени за злоупотребата с допинг агенти в спортната общност от началото на 70-те години. По това време тези комисии разработиха процедура за контрол на допинга, чиито основни елементи са валидни и до днес:

подбор на спортисти

процедура за вземане на проби от урина

анализ на проба А в акредитирана лаборатория на МОК

ако пробата А дава положителни аналитични резултати, анализ на пробата В в същата акредитирана лаборатория.

След това изслушването на спортиста се организира от медицинската комисия, където се решават евентуалните санкции срещу спортиста.

Международните организации създадоха списък с класове вещества и методи, които на спортистите е забранено да използват по време на състезания и тренировки. Последният списък, създаден от Световната антидопингова агенция (WADA) 19 за 2006 г., включва два вида стероиди:

типично екзогенните стероиди, за които основните примери са дадени на фигура 2 2

типично ендогенните стероиди - например андростендиол, андростендион, дехидроепиандростерон (DHEA), дихидротестостерон, тестостерон и сродни вещества.

Според статистиката на WADA за 2004 г., около 36% от положителната аналитична находка, декларирана от акредитираните антидопингови лаборатории, се отнася до анаболно-андрогенни стероиди. Сред 1191 положителни случая си струва да се спомене, че тестостеронът и нандролонът са най-използваните вещества (съответно 33% и 29% от случаите).

Тестовете за анаболни агенти в урината на спортисти са били широко прилагани по време на Олимпийските игри през 1976 г. в Монреал и по това време се основават основно на техники за радиоимуноанализ. Техниките за идентифициране и характеризиране на стероиди и техните метаболити в урината са се подобрили значително през последните две десетилетия. Това подобрение се дължи до голяма степен на използването на техники за газова хроматография-масова спектрометрия (GC-MS). Днес повечето антидопингови лаборатории използват техники, базирани на екстракция на твърда фаза на пробата от урина, последвана от химически модификации преди GC-MS анализ. 20 Процедурата за потвърждение в антидопинговия анализ се състои в недвусмислено доказване, че има съответствие между GC и MS свойствата на анаболния агент или неговия метаболит с тези на автентичен чист стандарт или на референтно изследване на екскрецията. 21.

Съотношението T/E

Други тестове за урина, като кетоконазолов тест 25 и съотношението тестостерон глюкуронид към лутеинизиращ хормон (T/LH) 26, са разработени, за да предотвратят допирането с тестостерон или предшественик. Въпреки това все още липсва референтен метод за измерване и идентифициране на LH и следователно съотношението T/LH е по-малко ефективно за справяне със законовите предизвикателства. 27 Откриването на тестостеронови естери в плазмата и космите също се предлагат като обещаващи решения за възпиране на допинга с инжекционни препарати от тестостеронови естери. 28, 29 Независимо от това, допинг контролът все още е ограничен върху проби от урина за откриване на допинг с тези вещества. Що се отнася до анализа на косата, беше установено, че тези Т естери се съхраняват лошо в космите и следователно само масивна и многократна употреба на тези вещества може да бъде открита в тази биологична матрица. 30

Какво вече е известно по тази тема

Анаболните стероиди са добавени към списъка на МОК със забранени вещества през 1975 г. Анаболните стероиди са синтетични производни на тестостерона, модифицирани, за да подобрят анаболните, а не андрогенните действия на хормона. Откриването на вещества, които не трябва да се произвеждат от организма, води до неблагоприятна аналитична находка. И обратно, за ендогенните хормони като тестостерон или DHEA е задължително да се определи произхода на стероида.

Преди пробата да бъде обявена за съвместима с допинг с тестостерон или предшественик, се провеждат допълнителни изследвания, като надлъжно проучване на съотношението T/E в урината. Като първа стъпка трябва да се направи сравнение с предишни стойности; ако няма налични предишни стойности, няколко допълнителни проби от урина се анализират за кратък период от време. Това надлъжно проучване може да представлява полезен инструмент за различаване на фалшиво положителните (естествено повишени съотношения T/E) от тези, дължащи се на манипулация на урината. 23 Съгласно насоките, дадени от WADA през 2004 г., пробите от урина трябва да бъдат подложени на масова спектрометрия с изотопно съотношение (IRMS), ако T/E е по-голяма или равна на 4,0 и концентрациите на тестостерон, тестостеронови метаболити, епитестостерон и DHEA са по-големи от фиксираните гранични концентрации. 31

Съотношение на въглеродните изотопи

Дори ако надлъжното проучване дава качествена информация за потенциалната манипулация на стероидния профил, липсват категорични доказателства за екзогенното приложение на естествени стероиди. Един от възможните начини за решаване на този проблем е съотношението на двата стабилни въглеродни изотопа 13 C/12 C, което може да позволи диференциацията на природните и синтетичните стероиди. Тъй като екзогенният тестостерон или прекурсори съдържат по-малко от 13 С от техните ендогенни хомолози, се очаква уринарните стероиди с ниско съотношение 13 С/12 С да произхождат от фармацевтични източници. 32 Ендогенните стероиди се произвеждат от холестерола в тялото. Холестеролът се получава от средно голямо разнообразие от фуражни растителни и животински прекурсори или синтезиран от прекурсори с фуражен произход.

В растителната тъкан основният източник на вариации в изотопното съотношение 13 C/12 C се получава от различните фотосинтетични пътища за фиксиране на въглеродния диоксид. Растенията включват въглероден диоксид чрез фотосинтеза по три различни механизма: път на цикъла на Калвин (C3), път на Hatch-Slack (C4) и път на метаболизма на crassulacean acid (CAM). Пътят на С3 води до голяма промяна в пропорциите на въглеродните изотопи спрямо атмосферния въглероден диоксид и следователно дискриминира по-силно спрямо по-тежкия изотоп 13 С в сравнение с пътя С4. Основни представители на групата С3 са пшеница, ориз, картофи, ечемик, грозде, овес и захарно цвекло, докато царевицата, захарната тръстика, просото и ананасът са важните видове от групата С4. 33 Разликата в обогатяването с 13 C на хранителни продукти в диетата и дори в хранителната верига се дължи на различния принос на естествено обогатени с 13 C съставки. Тъй като царевицата, просото и захарната тръстика (растения С4) са често срещаните хранителни съставки в някои райони на Африка, очаква се, че основното обогатяване на тялото с 13 С за организма ще бъде високо за местното население. 34 Известно е, че пробите от урина, събрани от държава като Кения, имат по-високо съдържание на 13 С в стероиди, отколкото западните или океанските страни. 35, 36

Методът за определяне на изотопния състав на съответния аналит включва газова хроматография, последващо изгаряне до CO2 и накрая, масспектрометричен анализ на този газ в специален мулти-колекционен масспектрометър (газова хроматография/изгаряне/съотношение на изотопната масова спектрометрия, GC/C/IRMS). 37 Стойността на 13 C/12 C на тестостерона или тази на неговите метаболити ще бъде измерена и сравнена с тази на референтните стероиди в урината в пробата, за да се вземат предвид вариациите в диетата на спортиста. 38, 39 В допълнение, трябва да се подчертае, че стойността на 13 C/12 C на тези ендогенни референтни съединения не трябва да се влияе от прилагането на стероиди. 40, 41 Резултатът ще бъде докладван като съвместим с приложението на стероид, ако се наблюдава значителна разлика между стойностите на 13 C/12 C на тестостероновите метаболити и ендогенното референтно съединение. 42 След проучвания на популацията, през 2004 г. от лабораторния комитет на WADA беше посочено различно ограничение за позитивност. Ако изследването IRMS не показва лесно екзогенно приложение, резултатът трябва да се отчете като неубедителен и при необходимост се извършват допълнителни надлъжни изследвания. 31

Какво добавя това проучване

От 1975 г. са разработени няколко стратегии и методи за възпиране на допинга с ендогенни стероиди. Този преглед описва това развитие, както и актуалните процедури, които трябва да се следват, за да се докаже прилагането на тестостерон или тестостеронови хормони.

Също така си струва да се спомене, че IRMS метод за определяне на стойностите на 13 C/12 C за епитестостерон в урината е разработен, за да осигури така необходимата допълнителна подкрепа за откриване на допинг с епитестостерон. 43 Епитестостеронът няма клинична употреба и не се предлага като фармацевтичен продукт. Това съединение е забранено от спортните власти, тъй като неговото приложение ще намали съотношението T/E в урината, маркер за приложението на тестостерон. 19.

Заключение

Въпреки че познанията за метаболизма на андрогенните стероиди са се увеличили през последните десетилетия и са предоставени аналитични насоки от спортните власти, откриването на допинг с тестостерон остава предизвикателство в спорта. Изчистването на перорално приетите естери на тестостерон е бързо и следователно анализът на лекарствените тестове за концентрацията в урината може да се извърши само през първите часове след приложението. 42 За да се увеличи чувствителността на откриването на тестостеронови естери, трябва да се проведат допълнителни изследвания за идентифициране на специфични биомаркери от този клас допинг агенти. Освен трудността на тяхното откриване в проби от урина, тези вещества се използват за положителни ефекти върху състоянията на настроението, а също и за намаляване на нивото на умора.

Съкращения

МОК - Международен олимпийски комитет

IRMS - масспектрометрия на изотопно съотношение

T/E - тестостерон към епитестостерон (съотношение)