Отделение по микробиология, тумор и клетъчна биология, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

клетъчни

Лаборатория „Наука за принадлежността към живота“, Медицински отдел „Солна“, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

Отделение по микробиология, тумор и клетъчна биология, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

Лаборатория „Наука за принадлежността към живота“, Медицински отдел „Солна“, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

Отделение по ревматология, имунология и алергия, Болница Brigham and Women, Бостън, Масачузетс, Съединени американски щати

Лаборатория „Наука за принадлежността към живота“, Медицински отдел „Солна“, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

Отделение по микробиология, тумор и клетъчна биология, Каролинска институт, Стокхолм, Швеция

  • Марк Д. Панас,
  • Тим Шулте,
  • Бастиан Таа,
  • Татяна Сандалова,
  • Нанси Кедерша,
  • Adnane Achour,
  • Джералд М. Макинерни

Фигури

Резюме

Ras-GAP SH3 свързващите домейни протеини (G3BP) са основни регулатори на образуването на стрес гранули (SG), цитозолни агрегати на протеини и РНК, които се индуцират при клетъчен стрес, като вирусна инфекция. Много вируси, включително вируса Semliki Forest (SFV), блокират индукцията на SG чрез насочване към G3BP. В тази работа ние демонстрираме, че G3BP-свързващият мотив на SFV nsP3 се състои от два FGDF мотива, при които както фенилаланинът, така и глициновият остатък са от съществено значение за свързването. В допълнение, ние показваме, че свързването на клетъчния G3BP-свързващ партньор USP10 също се медиира от FGDF мотив. Свръхекспресията на wt USP10, но не мутант, който няма FGDF-мотив, блокира сглобяването на SG. Освен това, ние идентифицирахме FGDF-медиирано G3BP свързващо място в херпес симплекс вирус (HSV) протеин ICP8 и показахме, че ICP8 свързването с G3BP също инхибира образуването на SG, което е нова функция на HSV ICP8. Представяме модел на триизмерната структура на G3BP, свързан с FGDF-съдържащ пептид, вероятно представляващ режим на свързване, споделен от много протеини за насочване към G3BP.

Резюме на автора

Стресовите гранули (SG) са динамични агрегати от протеини и транслационно заглушени иРНК, които се образуват в клетките при различни условия на стрес, като вирусна инфекция. Смята се, че SG са антивирусни и поради това много вируси са разработили противодействия за предотвратяване на тяхното образуване, често насочени към основния SG протеин G3BP. Тук показваме, че няколко иначе несвързани вирусни и клетъчни протеини свързват G3BP с мотива на последователността FGDF и по този начин потискат образуването на SG: неструктурният протеин 3 (nsP3) на алфавируса на стария свят Semliki Forest virus (близък роднина на нововъзникващ, високо патогенен вирус Chikungunya); протеинът ICP8 на вируса на херпес симплекс; и в допълнение, клетъчният протеин USP10 (SG компонент и протеинова деубиквитиназа, която стабилизира напр. туморния супресор p53). В тази работа ние също така представяме и потвърждаваме модел на триизмерната структура на G3BP, свързан с FGDF-съдържащ пептид. FGDF-медиираното свързване на G3BP представлява привлекателна цел за терапевтични интервенции срещу редица различни вирусни инфекции и може също да регулира p53-стабилизиращата функция на USP10 при ракови заболявания.

Цитат: Panas MD, Schulte T, Thaa B, Sandalova T, Kedersha N, Achour A, et al. (2015) Вирусни и клетъчни протеини, съдържащи FGDF мотиви, свързват G3BP с блокирането на образуването на гранули на стрес. PLoS Pathog 11 (2): e1004659. https://doi.org/10.1371/journal.ppat.1004659

Редактор: Марк Т. Хайсе, Университет на Северна Каролина в Чапъл Хил, САЩ

Получено: 20 септември 2014 г .; Прието: 6 януари 2015 г .; Публикувано: 6 февруари 2015 г.

Наличност на данни: Всички релевантни данни се намират в хартията и нейните поддържащи информационни файлове.

Финансиране: Това изследване беше подкрепено от безвъзмездна помощ по проект Cancerfonden (Шведско раково общество) (CF 2012/789) на GMM. Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

SGs се индуцират от много вирусни инфекции и на свой ред вирусите са развили много контрамерки, често насочени към G3BP [18]. Сглобяването на SG при полиовирусна инфекция се инхибира чрез разцепване на G3BP между остатъци Q325 и G326 от вирусната 3C протеаза [19], разделяща NTF2-подобни и RRM домейни и води до образуването на различни по състав композиции, липсващи G3BP [20]. За някои вируси G3BP се набира до огнища на натрупване на вирусен протеин и може да бъде от значение за ефективното завършване на жизнения цикъл на вируса. В заразени с вирус на ваксиния (VV) клетки G3BP се набира в цитоплазматичните вирусни фабрики [21]. Съобщава се обаче, че има и антивирусна роля при VV инфекция [22]. По същия начин G3BP е замесен като потенциален компонент на комплекса за репликация на вируса на хепатит С (HCV) [23] и може да играе важна роля в сглобяването на вируса [24]. Ние и други показахме, че подобен на G3BP NTF2 домейн е пряко свързан с L/ITFGDFD повтарящи се мотиви в С-краищата на неструктурния протеин (nsP) 3 на алфавирусите от Стария свят, включително вируса Semliki Forest (SFV) и чикунгуня вирус (CHIKV) [25–28]. Последващото секвестиране на G3BP към огнища на натрупване на вирусен протеин прави заразените клетки неспособни да съберат SG, въпреки поддържаните високи нива на eIF2α фосфорилиране [28,29].

В тази работа ние се стремим да дефинираме точно характеристиките на G3BP-свързващия мотив в алфавируса на Стария свят nsP3. Установихме, че основният свързващ мотив се състои от два остатъка от фенилаланин, разделени от глицин и остатък от аспартат (FGDF). Мутацията на който и да е от тези остатъци предотврати свързването с G3BP-1 или G3BP-2. Също така откриваме FGDF мотиви в N-края на USP10 и в C-края на херпес симплекс вирус (HSV) -1 протеин ICP8 и потвърдихме, че тези мотиви свързват по подобен начин G3BP и блокират индукцията на SG. И накрая, генерирахме молекулярен модел на взаимодействието на пептид G3BP/FGDF и утвърдихме модела чрез насочена към сайта мутагенеза. Тези резултати разкриват механизма, по който поне два патогенни вируса са насочени към G3BP. Освен това те също така осигуряват молекулярна основа за регулиране на активността на USP10 чрез сглобяване на инхибиторния комплекс USP10/G3BP.

Резултати

G3BP-свързващият домейн в SFV nsP3 съдържа основен свързващ мотив на FGDF

(А) С-терминални последователности на pEGFP-C1, pEGFP-nsP3-31-wt, -T2A, -F3A, -G4A, -D5A, -F6A или -D7A. Мутациите на аланин са показани с получер шрифт. (B) BHK клетките бяха подменени трансфектирани (М) или трансфектирани с pEGFP-nsP3-31-wt, -T2A, -F3A, -G4A, -D5A, -F6A или -D7A или pEGFP-C1. Клетъчните лизати бяха приготвени 16 часа след трансфекцията и имунопреципитирани с анти-GFP или G3BP-1 антисеруми и разделени чрез SDS-PAGE и прехвърлени в нитроцелулоза. Блотове от общо лизати и IP бяха изследвани за G3BP-1, GFP или актин.

SFV-F3A не изолира G3BP, индуцира по-силен SG отговор и се отслабва в тъканната култура

(A) BHK клетки са заразени при MOI 10 със SFV-wt или SFV-F3A. При 8 hpi се приготвят клетъчни лизати и се имунопреципитират с G3BP-1 антисеруми и се разделят чрез SDS – PAGE. Лизатите и IP се изследват за nsP3, G3BP-1 или актин. (B) MEF клетки бяха заразени със SFV-wt или SFV-F3A при MOI 1. При 8 hpi клетки бяха фиксирани и оцветени за nsP3 (зелено), G3BP-1 (червено) и TIA-1 (синьо). Лента 20 μm. (C) MEF клетките бяха подправени инфектирани или заразени със SFV-wt или SFV-F3A при MOI от 50 в продължение на 7 часа преди 1 h третиране с Pat A (100 nM) или фалшиво лечение. Клетките бяха фиксирани и оцветени за G3BP-1, TIA-1 и nsP3. Петдесет клетки на лечение се оценяват като SG + или не на базата на G3BP-1 и TIA-1 колокализация. Данните са представени като средно ± SD от пет независими експеримента. Отворени решетки, обработени с макет затворени ленти, Pat A. Тест за неспарен студент, ** p Фигура 3. USP10 свързва G3BP чрез запазен мотив FGDF.

След това се постарахме да потвърдим стехиометрията 2: 1 на nsP3: G3BP, използвайки биофизични измервания in vitro. Използвахме изотермична титруваща калориметрия (ITC), за да определим афинитета, стехиометрията и термодинамичния подпис на взаимодействието между пречистения NTF2-подобен домен на човешки G3BP-1, изразен в E. coli (G3BP-NTF2), и пептидни обхващащи остатъци 449 –473 от SFV nsP3 (nsP3-25), съдържащ два FGDF мотива. Инжектирането на nsP3-25 в протеинов разтвор на G3BP-NTF2 води до зависими от концентрацията екзотермични топлинни промени (Фиг. 4C, горен панел). Изотермата на свързване на интегрираните топлинни промени е монтирана с помощта на прост модел на свързване един към един, като се получава стойност на афинитет от 7 μM, както и 2,4 G3BP свързващи места за nsP3-25 пептидна молекула (фиг. 4С, долния панел). Това показва, че един пептид ефективно свързва две G3BP молекули. Афинитетът на взаимодействието е 16 пъти по-силен от предварително определената стойност на афинитет от 115 μM за взаимодействието между подобен G3BP-NTF2 фрагмент и DSGFSFGSK пептид [33]. Инжектирането на контролен пептид, при който и двата FGDF мотива са обменени за AGDA (nsP3-25-mut), само води до топлинни колебания, свързани с инжектирането на базово ниво (Фиг. 4D).

Ангажирането на две G3BP молекули с всеки nsP3-25 пептид беше допълнително подкрепено от анализ на аналитична хроматография за изключване на размера (SEC). От кристални структури и SEC анализ е известно, че NTF2-подобни домейни на плъх и човешки G3BP образуват хомодимери [33]. Само G3BP-NTF2 се елуира с привидно молекулно тегло 30 kDa, малко по-ниско от изчисленото молекулно тегло на димера (36 kDa), докато предварителната инкубация на G3BP с десеткратен моларен излишък на nsP3-25 пептид измества пик на елуиране, съответстващ на образуването на 60 kDa комплекс (Фиг. 4Е). Като се вземе предвид съотношението 2: 1 за взаимодействието G3BP-NTF2: nsP3-25, получено от ITC (фиг. 4C), предполагаме, че образуваният комплекс от 60 kDa включва четири молекули G3BP-NTF2 (два димера) и два nsP3- 25 пептида. Няма данни за олигомери от по-висок порядък.

Глициновият остатък от FGDF мотива позволява адекватно позициониране на двата фенилаланинови остатъка в хидрофобна бразда в G3BP NTF2-подобен домейн

Кристалните структури на NTF2-подобния домен на G3BP-1 в неговата апо форма и комплексирани с нуклеопориновия (Nup) -изведен пептид DSGFSFGSK са наскоро определени [33], разкривайки, че лигандът е свързан в разширена конформация в рамките на дълъг и дълбок жлеб на повърхността на G3BP (S6A фиг.). Мястото на свързване на пептида е амфипатично; докато основата на браздата е силно хидрофобна, и двете стени, облицоващи цепнатината на протеина, и положително зареденият N-край са полярни с няколко основни остатъка (R32, K5, K123). И двата фенилаланинови остатъка от пептида изпъкват към добре дефинирани джобове в хидрофобната бразда. Докато страничната верига на остатъка F4 от пептида, получен от Nup, е заровена в дълбок джоб, образуван от остатъците G3BP-1 F15, F33 и F124, страничната верига на остатъка F6 е локализирана в по-плитък джоб, образуван от G3BP-1 остатъци F124, V11 и L10 [33].

(A) G3BP-NTF2 (PDB ID: 4FCM) с моделиран пептид LTFGDFDE (жълти пръчки). Протеинът е показан като повърхност, оцветена според електростатичния потенциал (червено: киселинно, синьо: основно). (Б) Подробности за взаимодействието на пептида с G3BP-NTF2. G3BP-NTF2 е показан в анимационното изображение. N-крайните остатъци 11, както и няколко остатъка, облицоващи пептид-свързващия жлеб, се показват като сиви пръчки. Пептидът LTFGDFDE се показва като жълти пръчици, остатъците от пептидни аминокиселини са обозначени с червено и удебелен шрифт. Остатъците от G3BP-1, споменати в текста, са обозначени в черно.

Сайт-насочена мутагенеза в FGDF пептидно свързваща цепнатина на G3BP

(А) Схематично представяне на мутанта G3BP-F33W (горен панел) и мутанта G3BP-F124W (долен панел) с моделирания LTFGDFDE пептид. Пептидът LTFGDFDE се показва като пръчки с жълти въглеродни атоми. Мутиралите остатъци от триптофан са показани в магента. (B) HEK293T клетките бяха подменени трансфектирани или котрансфектирани с pEBB/PP-SFV-nsP3 (pnsP3) и или pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt, -F33W или -F124W. Клетъчните лизати бяха приготвени 24 часа след трансфекцията, имунопреципитирани с анти-GFP и разделени чрез SDS-PAGE. Лизатите и IP се изследват с помощта на стрептавидин-HRP (nsP3), GFP или актин. (C) HEK293T клетките бяха подменени трансфектирани или трансфектирани с pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt, -F33W или -F124W. Клетъчните лизати се приготвят 24 часа след трансфекцията и се имунопреципитират с GFP антисеруми и се разделят чрез SDS-PAGE. Лизатите и IP са изследвани за USP10, GFP или актин. (D) Схематично представяне на G3BP1-Δ1-11 с моделирания LTFGDFDE пептид. Пептидът LTFGDFDE се показва като пръчки с жълти въглеродни атоми. (E) HEK293T клетки бяха подменени трансфектирани или трансфектирани с pEGFP-C1, pEGFP-G3BP1-wt или -Δ1-11. Клетъчните лизати се приготвят 24 часа след трансфекцията и се имунопреципитират с анти-GFP и се разделят чрез SDS-PAGE. Лизатите и IP са изследвани за USP10, GFP или актин.

Крайният N-край на G3BP (остатъци 1-11) образува голяма част от хидрофобния джоб за позициониране на пептидния остатък F6 и също така съдържа остатък от лизин (K5), вероятно взаимодействащ с отрицателните заряди на киселинните остатъци надолу по веригата FGDF мотив. Моделът прогнозира, че пресечена версия на G3BP (Δ1-11) не би била способна да свързва пептида (фиг. 6D). За да се оцени това, 293T клетки бяха трансфектирани с pEGFP-C1, pEGFP-G3BP-wt или pEGFP-G3BP-∆1-11 и анализирани чрез имунопреципитация с анти-GFP и имуноблотинг за USP10, GFP или актин (фиг. 6Е). Ендогенният USP10 се утаява с EGFP-G3BP-wt, но не и с EGFP-G3BP-∆1–11. Взети заедно, резултатите от фиг. 6 силно подкрепят нашия структурен модел на комплекса G3BP/FGDF.

Мотивът на FGDF в HSV-1 ICP8 свързва G3BP и инхибира SGs