РЕЗЮМЕ

Затлъстяването е един от най-разпространените здравословни проблеми в Съединените щати. Хората със затлъстяване имат повишен риск от развитие на други здравословни проблеми като сърдечни заболявания, високо кръвно налягане и диабет тип 2. Не е напълно ясно защо хората със затлъстяване имат този повишен риск, но наскоро е установена някаква връзка с имунната система чрез механизъм, включващ нискостепенно възпаление. В този проект диета с високо съдържание на мазнини се използва за предизвикване на затлъстяване при мишки, за да се моделира затлъстяването при хората, докато диетата с ниско съдържание на мазнини се използва като контрол за слаби мишки. Моноцитите, експресиращи високи нива на Ly-6C, бяха специално изследвани поради техните противовъзпалителни ефекти. Използвайки флуоресцентно сортирано клетъчно сортиране и конвенционална микроскопия, преобладаването на Ly-6C високи моноцити е количествено определено в далака и бялата мастна тъкан на слаби и затлъстели мишки. Резултатите показват, че индуцираното от диетата затлъстяване при мишки е увеличило броя на Ly-6C високо моноцити в двете тъкани. Тези наблюдения предполагат, че провъзпалителните моноцити могат да играят роля при генерирането на хроничното възпаление, свързано със затлъстяването.

допринася

ВЪВЕДЕНИЕ.

Затлъстяването се превърна в един от най-разпространените глобални здравословни проблеми при хората. Съществуват безброй здравословни проблеми, свързани със състоянието, тъй като то увеличава риска от развитие на други заболявания като сърдечно-съдови заболявания, метаболитен синдром и диабет тип 2 [1]. Затлъстяването се развива, когато прекомерните мастни натрупвания в бялата мастна тъкан на организма (WAT). Често се характеризира с нискостепенно хронично възпаление, което е основен фактор, допринасящ за развитието на заболявания, свързани със затлъстяването [1].

Дългогодишната хипотеза в имунологичната област беше, че моноцитите са едни от малкото имунни клетки в постоянна циркулация в цялото тяло. Смятало се е, че само при навлизане в тъканите тези циркулаторни моноцити могат да се диференцират в макрофаги или дендритни клетки [2]. Противно на това схващане, далакът е открит, че служи като резервоар за моноцити, поради което показва, че моноцитите не са строго циркулиращи [2]. Освен това тези далачни моноцити могат да бъдат разположени от далака до различни възпалителни места около тялото. Има две подгрупи моноцити, които могат да бъдат намерени в тъканите на далака и това са Ly6c с високи моноцити и Ly6c с ниски моноцити [2]. Провъзпалителните Ly6c високи моноцити са отговорни за смилането на увредената тъкан, докато Ly6c ниските моноцити са противовъзпалителни и основно участват в разрешаването на възпалението и насърчаването на зарастването на рани.

Друга подгрупа от миелоидни мононуклеарни клетки, макрофаги на мастната тъкан (ATM), са станали по-често изследвани по отношение на връзката им със затлъстяването. По-специално, един установи, че банкоматите се натрупват в WAT и играят значителна роля при свързаното със затлъстяването възпаление [1]. След това тези банкомати могат да се размножават и да насърчават миелопоезата, производството на миелоидни имунни клетки и моноцитозата, производството на моноцити, особено когато даден организъм е със затлъстяване [1].

Банкоматите се намират по-често във висцералната мастна тъкан, а не в подкожната мастна тъкан, която представлява слой мазнина, разположен точно под кожата [3]. Висцералната мастна тъкан е мастна тъкан, която може да се намери в коремната кухина и може да се натрупва около органите. Това е видът мазнини, които могат да се натрупват при затлъстели индивиди. Въпреки че затлъстяването може да насърчи разпространението на макрофаги в мастната тъкан, то не увеличава тяхното разпространение в други тъкани [3]. Тези доказателства карат изследователите да предполагат, че в мастната тъкан има уникална среда, която е необходима за насърчаването на повишената пролиферация и натрупване на моноцити и макрофаги, установени при затлъстяване [3].

Поради известния принос на далака при разгръщане на възпалителни моноцити при възпалителни състояния и факта, че моноцитите могат да доведат до макрофаги в WAT, този изследователски проект се стреми да оцени дали провъзпалителните моноцити са увеличени в мастната тъкан или не, когато в условия на затлъстяване. Далакът беше допълнително анализиран, за да се изследва дали този орган е разположил Ly6c високи моноцити в мастната тъкан като възпалително място. Предполага се, че затлъстяването е свързано както с локализацията на провъзпалителни моноцити в мастната тъкан, така и с набирането на моноцити на далака. Този резултат би довел до откриването на по-малко моноцити в далака, когато даден организъм е със затлъстяване. По-пълната характеристика на локализацията на имунните клетки ще бъде полезна за насочване на изследователите да разберат по-добре възпалението, свързано със затлъстяването и следователно да лекуват един аспект на свързаното със затлъстяването възпаление.

МЕТОДИ.

Индуциране на затлъстяване.

Изследването използва затлъстяване, индуцирано от диета (DIO) при мишки, за да моделира затлъстяването при хора. Използвани бяха мъжки мишки от див тип C57BL/6J (B6) поради тяхната чувствителност към DIO. Експерименталните мишки са били хранени с диета с високо съдържание на мазнини (HFD) в продължение на 12 седмици, за да предизвикат затлъстяване. Контролните мишки са получили диета с ниско съдържание на мазнини (LFD), за да осигурят основа за сравнение. След 12 седмици на тестовите диети се набавя за анализ слезка и мастна тъкан.

Изолиране на стромална съдова фракция от бяла мастна тъкан.

Перигонадната висцерална бяла мастна тъкан се смила и смила при 37 ° С в продължение на 1 час, като се използват 10 ml разтвор на Collegenase I (1 mg/ml в среда RPMI 1640). Процесът на храносмилане се спира чрез добавяне на 40 ml промивна среда (среда RPMI 1640, съдържаща 5% фетален говежди серум (FBS) към всяка проба. След това пробите се центрофугират при 1300 оборота в минута в продължение на 10 минути при 4 ° С. Супернатантата се отстранява и червените кръвни клетки бяха лизирани с използване на 0,5 ml ACK лизиращ буфер в продължение на 5 минути. След спиране на тази реакция чрез добавяне на 10 ml промивна среда, клетките бяха центрофугирани още веднъж при същите условия. Супернатантът беше отстранен и пелетата беше ресуспендирана в RPMI, съдържащ 10% FBS. Изолираните клетки (стромална съдова фракция, SVF) се състоят от имунни клетки, съдови клетки и други стромални клетки.

Изолиране на спленоцити.

Далакът се пресова през 70-um око в 10 ml промивен буфер, за да се отдели тъканта. След това този разтвор, съдържащ спленоцити, се центрофугира при същите условия, както е описано по-горе, за да се съберат клетките от далачната тъкан. За да се лизират червените кръвни клетки в тази по-голяма проба, бяха използвани 5 ml ACK лизиращ буфер и реакцията беше спряна след 5 минути чрез добавяне на 10 ml промивна среда. Имунните клетки се събират и суспендират в RPMI буфер, съдържащ 10% FBS, както е описано по-горе.

Клетъчно оцветяване.

Поточна цитометрия.

Пробите се анализират с 4-цветен поточен цитометър. След това на поточния цитометър бяха настроени конкретни порти за събиране на 500 000 събития. Събраните данни бяха визуализирани и анализирани с помощта на софтуера FlowJo.

РЕЗУЛТАТИ.

Сместа от антитела ефективно позволява на поточната цитометрия да идентифицира клетки от миелоидна линия.

Клетъчните разтвори се подават към препаративен поточен цитометър за изолиране на отделени клетъчни субпопулации за микроскопия. Миелоидните клетки могат да се видят успешно отделени от лимфоидните клетки в допълнителна фигура 1. Клетъчните снимки са с подобен размер и варират само във формата на ядрото. Наличието на по-малки клетки би предположило, че проточният цитометър не е изолирал ефективно миелоидни клетки от лимфоидни клетки.

Проточна цитометрия Gating за Ly6c високо-възпалителни моноцити.

За тъканите на далака се наблюдава незначително намаляване на броя на моноцитите, макрофагите, дендритните клетки, когато се отделят единствено миелоидните и лимфоидните клетки, както се вижда на Фигура 1. Процентът на миелоидните клетки, попаднали в първата порта на поточния цитометър за слабата мишка е 0,862%, а процентът за затлъстелата мишка е 0,722%. Процентът, получен от поточния цитометър, е общият брой на клетките, преброени в затворената площ върху общия брой клетки на този специфичен парцел.

Фигура 1. Честотата на далачните макрофаги, моноцити и дендритни клетки е сравнима при слаби и затлъстели мишки. Мишките се хранят с HFD или LFD и след 12 седмици далаците се събират и анализират за макрофаги, моноцити и дендритни клетки чрез поточна цитометрия. Честотите на макрофагите, моноцитите и дендритните клетки (CD11b + CD90- B220- NK1.1-, Ly6G-, Siglec F-) са посочени в синьо.

Въпреки това, когато макрофагите и дендритните клетки се отделят от провъзпалителните моноцити, се установява увеличение с 15,1% в процента на провъзпалителни моноцити, когато са в затлъстяла среда, показана на фигура 2.

Фигура 2. Затлъстяла среда в далака увеличава разпространението на провъзпалителни моноцити. Въпреки че броят на събитията дефинира, че на участъка за постната мишка има близо 2000 клетки повече, затлъстелата мишка има по-висок процент от своите клетки, които могат да бъдат намерени в портата с висок моноцит Ly6c.

В бялата мастна тъкан има очевидно увеличение (16,62%) в процента на моноцити, макрофаги и дендритни клетки. (Фигура 3). Графиката със затлъстяване показва, че все още има по-голям процент макрофаги, моноцити и дендритни клетки, отколкото постните клетки на мишката, въпреки по-ниския общ брой клетки.

Фигура 3. Мастната тъкан също показва повишено разпространение на макрофаги, моноцити и дендритни клетки. Има увеличение, което е ясно видимо в затлъстелия парцел в сравнение с постно. Въпреки че в постния участък бяха преброени повече клетки, все още имаше по-голям процент в миелоидната имунна клетка за затлъстелата мишка.

Това увеличение не говори нищо за общия брой макрофаги, моноцити и дендритни клетки, които могат да бъдат намерени в мастната тъкан. По-скоро се посочва, че при затлъстели мишки имунните клетки в мастната тъкан са по-склонни да се състоят от макрофаги, моноцити и дендритни клетки.

Фигура 4. Честотата на възпалителните моноцити в мастната тъкан също показва видимо увеличение. Налице е процентът на провъзпалителни моноцити, но не е толкова голям, колкото на Фигура 4. Тези участъци имат различна аномалия, при която броят на клетките, отчетени в участъка със затлъстяване, е с близо 3000 повече от броя, отчетен в постния участък.

Установено е също така, че има увеличение на процента на провъзпалителни моноцити в мастната тъкан при затлъстели мишки в сравнение с постните контроли (Фигура 4). Увеличението е по-малко забележимо от увеличаването на макрофагите, моноцитите и дендритните клетки, намерени на Фигура 3, и е по-малко от увеличаването на процента на провъзпалителни моноцити в тъканите на далака на Фигура 2.

ДИСКУСИЯ.

Сместа от антитела, използвана в това проучване, беше успешна при идентифицирането на различните видове имунни клетки, които могат да бъдат намерени в тъканите на далака или в мастната тъкан. Това се определя чрез преглед на клетките, подложени на флуоресцентно активирано клетъчно сортиране (FACS). Морфологията на идентифицираните клетъчни субпопулации може да бъде потвърдена с помощта на силен микроскоп (допълнителна фигура 1). Чрез систематичен преглед на всяка от пробите, завъртяни след всяка порта по време на поточна цитометрия, беше определено фенотипично, че разтворът на антитялото е достатъчен за отделяне на миелоидни клетки от лимфоидни имунни клетки и по-специално моноцити от макрофаги и дендритни клетки. Също така, моноцитите също бяха успешно разделени от интензивността, с която те експресираха Ly-6C.

Резултатите от проточната цитометрия от далака са неочаквани, тъй като се предполага, че затлъстяването ще увеличи количеството на миелоидните имунни клетки. е горните резултати се подкрепят от литературата, че далакът е резервоар за моноцити и други имунни клетки и ги разгръща в цялото тяло по време на възпаление [2]. Това е възможно обяснение за лекото намаляване на процента на миелоидни имунни клетки на фигура 1. Въпреки че предишно проучване специално обсъжда драстично намаляване на броя на моноцитите в далака след миокарден инфаркт или инфаркт, е приложимо към това изследване, въпреки че затлъстяването е по-често свързано с хронично възпаление, а не с острото възпаление, което възниква по време на инфаркт на миокарда [2]. Въпреки че има разлики между характеристиките на острото възпаление и хроничното възпаление, наблюдението, че процентът на миелоидните клетки общо намалява, когато е в среда със затлъстяване, е показателно за някакво състояние на възпаление в организма.

От резултатите от проточната цитометрия на далачната тъкан не може да се определи дали възпалението, предизвикало разгръщането на имунни клетки от далака, е причинено от затлъстяване. На Фигура 2, увеличаването на процента на миелоидни клетки и по-специално на Ly-6C високо-възпалителни моноцити е показателно за действително възпаление в мастната тъкан, което дава възможни разсъждения защо далакът при затлъстелите мишки е имал по-малък процент от миелоидни имунни клетки, ако са били изпратени в мастната тъкан, за да стимулират възпалението. Както на Фигура 3, така и на Фигура 4 процентът на миелоидните клетки и процентът на провъзпалителни моноцити се увеличават, което дава още повече аргументи за съществуването на някаква връзка между затлъстяването, възпалението и миелопоезата.

Въпреки че беше установено, че затлъстяването наистина е натрупвало провъзпалителни моноцити в мастната тъкан, е необходима повече работа за определяне на механизма зад това. Също така би било полезно да научите дали това хронично възпаление, причинено от затлъстяване, в крайна сметка нарушава функцията и ефективността на имунните клетки, подобно на автоимунно заболяване. Въпреки че ще трябва да се направят повече изследвания, за да се обяснят допълнително физиологичните и биологичните ефекти на затлъстяването върху имунната система, информацията, научена от този проект, предоставя на другите път да продължат да стъпват в правилната посока, докато ефектът на затлъстяването върху имунната система не бъде напълно разбрано.

ПРИЗНАВАНИЯ.

Бих искал да благодаря на Училището за наука и математика във Вандербилт, че ми даде възможността да правя изследвания във Вандербилт това лято. Бих искал също да призная лабораторията на Ван Каер, че ми предостави всички ресурси, необходими за провеждането на моите изследвания. Най-важното е, че бих искал да благодаря на моя наставник д-р Ву, че ме научи на всички умения, необходими за завършването на този проект, винаги отговаря на безбройните ми въпроси и за нейната непоклатима подкрепа. Бих искал също да благодаря на д-р Ийдс за цялата й подкрепа и помощ при представянето на моите изследвания в различни научни центрове.