Резюме

Въведение

Поради повишаване на чернодробната секреция на триглицериди (TG) и намаляване на плазмения клирънс на TG, концентрациите на TG в майката постепенно се увеличават по време на бременност (1–3). TG на майчината кръв осигуряват липиди не само за растежа на плода, но и като енергиен субстрат за метаболизма на плацентата. Нивата на TG в майчината кръв са положително свързани с теглото при раждане както при здрави бременности (1,4,5), така и при бременности, усложнени със затлъстяване и гестационен диабет (5-9). След корекция за ИТМ на майката и кръвната глюкоза, концентрацията на TG в кръвта на майката е идентифицирана като силен независим предиктор за теглото при раждане и затлъстяването на бебето (6–10). Следователно, нивото на TG в майчината кръв е от съществено значение за растежа на плода и развитието на мазнини.

кръвта

Силната връзка на затлъстяването и ненормалния липиден метаболизъм е добре документирана от хора до животински модели. Затлъстяването на майките, особено затлъстяването с бременност, е определено като ключов рисков фактор за много неблагоприятни резултати от бременността. Нашето разбиране за въздействието на затлъстяването върху адаптацията на майката при метаболизма на липидите към бременността е ограничено. Въпреки че се наблюдават повишени концентрации на TG на гладно и след хранене при бременност, усложнена със затлъстяване (7,9), проучвания съобщават, че затлъстелите жени имат по-слабо изразено покачване на концентрацията на TG в кръвта по време на бременност (5,11–14). По-интересното е, че нашето проучване на мишки разкрива, че храненето с високо съдържание на мазнини (HF) по време на бременност значително намалява TG на майчината кръв, въпреки повишаването на затлъстяването (15). Следователно беше оправдан системен експеримент за изследване на ефектите от затлъстяването върху повишаването на концентрацията на TG в майчината кръв по време на бременност, наричана по-нататък траектория на TG и основния механизъм.

Липопротеиновата липаза (LPL) е основният двигател на клирънса на TG в кръвта. LPL активността се регулира отрицателно от няколко ангиопоетиноподобни протеини (ANGPTL) (16–19). ANGPTL4 е най-мощният инхибитор на LPL в семейството на ANGPTL (17,20,21) и е силно експресиран в бяла мастна тъкан (WAT) и кафява мастна тъкан (BAT) (20,22). След секреция от клетки, ANGPTL4 може да се разцепи в N-краен домейн и COOH-терминален фибриноген-подобен домейн (23,24). Доменът с навита намотка на N-края инхибира LPL активността (25). Експресията на ANGPTL4 се увеличава значително по време на бременност (26-28).

Използвайки модели на мишки, нашите настоящи проучвания показват, че HF (ppHF) храненето с препрегнация предизвиква затлъстяване на майката. В сравнение с контролните (Con) язовири, концентрациите на TG в майчината кръв са значително по-ниски при ppHF язовирите. Въпреки че храненето с ppHF повишава експресията на UCP1, резултатите от нокаутиране на гена Ucp1 (Ucp1 -/-) изключват приноса на UCP1 в траекторията на TG на майчината кръв с намалено затлъстяване. По-нататък нашето проучване разкри, че ppHF храненето значително повишава LPL активността на кръвта след хепарин, но не показва значителен ефект върху чернодробната секреция на TG или абсорбцията на TG в червата след хранене. Значително е, че ниските нива на експресия на Angptl4 са наблюдавани в междулопаточната НДНТ (iBAT), гонадната WAT (gWAT) и черния дроб на язовирите, хранени с ppHF. Предизвиканото от бременността повишаване на концентрацията на TG в майчината кръв беше почти премахнато при язовирите с дефицит на ген Angptl4 (Angptl4 -/-). Важно е, че свръхекспресията на ANGPTL4 възстанови концентрациите на TG в майчината кръв в майките на ppHF. Заедно това проучване показва, че ANGPTL4 играе решаваща роля за повишаване на концентрацията на TG в майчината кръв по време на бременност. Затлъстяването при майките влошава нарастването на траекторията на TG в кръвта на майката, като намалява експресията на Angptl4 при мишки.

Изследователски дизайн и методи

Материали

Експериментални животни

C57BL/6 и Ucp1 -/- мишки бяха от лабораторията Джаксън (Bar Harbor, ME). Angptl4 -/- мишките са получени от Мутантния мишен ресурсен и изследователски център и са пресечени за 10 поколения в C57BL/6 фон (29,30). Някои женски мишки C57BL/6 и Ucp1 -/- са били хранени с HF или диета с ниско съдържание на мазнини в продължение на 12 седмици и след това редовно чау 2 седмици преди чифтосването и по време на бременност. Сирите се хранеха с чау. За да се избегнат ефекти от фетусите, мишките Ucp1 -/- и Angptl4 -/- бяха кръстосани с мишки от див тип (WT), за да се получат потомство Ucp +/− или Angptl4 +/−. Бременността се определя от наличието на вагинална тапа и се определя ембрионалната възраст (E) 0,5. Съставът на тялото на майката се наблюдава от EchoMRI. Кръвни проби от майката са събрани в хранено състояние в ∼9: 00 до 10:00 ч. За ектопично свръхекспресия на ANGPTL4, 1 × 10 6 образуващи плака единици от пречистени аденовирусни вектори, кодиращи човешки ANGPTL4 (Ad-hANGPTL4) или зелен флуоресцентен протеин (Ad -Gfp) се инжектират през опашната вена в язовири при E11.5 и проби се събират при E14.5 (31). Експерименти с използване на модели на мишки бяха проведени в съответствие с насоките на Асоциацията за оценка и акредитация на лабораторни грижи за животните с одобрение от Комитета за грижа и употреба на животните в Калифорнийския университет в Сан Диего.

Анализ на степента на освобождаване на чернодробната TG

Нашето предишно проучване показа, че концентрацията на TG в майчината кръв достига пикове при E14,5 (31). Следователно, степента на чернодробна секреция на TG при майката е измерена при E14,5 след блокиране на ендогенната LPL активност чрез интравенозно инжектиране на Poloxamer 407 (1 000 mg/kg) (BASF Corporation, Mount Olive, NJ). Мишките са гладували цяла нощ преди инжектиране. Поредица от кръвни проби бяха събрани преди и след инжектирането на Poloxamer 407. Концентрациите на TG в кръвта се измерват с помощта на комплект Wako. Скоростите на освобождаване на TG в черния дроб са изчислени чрез натрупване на концентрации на TG в кръвта, както описахме по-рано (32).

Тест за липидно натоварване

Бременни мишки (Е14.5) се гладуват цяла нощ и се хранят орално със слънчогледово масло (0.4 мл). Кръвни проби бяха събрани от опашната вена преди и на 1, 2, 3, 4 и 5 часа след сонда. За да се определи чревната секреция на TG при постпрандиални състояния, мишките се инжектират с LPL инхибитор Poloxamer 407 10 минути преди сонда. Определени са концентрациите на TG в кръвта и са изчислени скоростите на повишаване.

Постхепаринов плазмен LPL анализ на активността

За да се освободи прикрепеният към ендотелните клетки LPL в кръвта, хепарин (0,2 μ/g телесно тегло) се инжектира в мишки през вената на опашката. Кръвни проби се събират 10 минути след инжектирането и се приготвят плазмени проби. Постхепариновата плазмена активност на LPL се определя с помощта на флуорометричен комплект за анализ, както описахме по-рано (15).

Western Blot и PCR анализи в реално време

Протеиновите проби бяха извлечени от iBAT или други тъкани и разделени с помощта на NuPAGE гелове. Протеините бяха попити с посочените антитела (вижте подробности във фигурните легенди). Лентите от Western blots са количествено определени с помощта на софтуера Quantity One (Bio-Rad). Общата РНК се приготвя от тъкани, използвайки TRIzol. cDNA се синтезира с помощта на SuperScript III Reverse Transcriptase и олиго (dT) 12-18 праймер. PCR в реално време се извършва с помощта на QuantStudio 3 PCR система в реално време (Invitrogen) със специфични двойки праймери (Таблица 1). Данните за експресията се нормализират до количеството на β-актин.

Последователности за PCR праймери в реално време

Статистически анализ

Сравнявайки нивата на иРНК за гени за липиден метаболизъм в мазнините и черния дроб, открихме значително намаляване на нивата на mRNA на Angptl4 в gWAT, iBAT и черния дроб на ppHF язовирите (фиг. 2E и 4G и H и допълнителна фигура 3A). За да се изследва ролята на намалената Angptl4 в ppHF хранене - намалена TG траектория на майчината кръв, беше използван аденовирусно-медииран in vivo чернодробен трансдукционен подход за ектопично експресиране на човешки протеин ANGPTL4 при бременни мишки (31) (Допълнителна фигура 3B). В съответствие с проучванията на небременни мишки (24), концентрациите на TG в майчината кръв са значително увеличени при третирани с Ad-hANGPTL4 бременни мишки (Фиг. 4I). Най-важното е, че намаляването на концентрациите на TG в майчината кръв в майките на ppHF е отслабено чрез експресия на ANGPTL4 (Фиг. 4I). Заедно тези резултати показват, че намалената експресия на Angptl4 лежи в основата на затлъстяването, нарастващо на TG траекторията на майчината кръв по време на бременност.

Дискусия

Богатите на TG липопротеинови частици са основни средства за транспортиране на липидите на майката до плацентата и феталното отделение. Чрез поредица от координирани майчини метаболитни адаптации, концентрацията на TG в майчината кръв непрекъснато се увеличава до значително високо ниво, за да се осигури фетално снабдяване с липиди. Следователно, в допълнение към глюкозата и аминокиселините, поддържането на физиологична хипертриглицеридемия в майчиното кръвообращение е жизненоважно за развитието и растежа на плода (1,6,10). Използвайки генетични модели на мишки, нашето проучване разкри критична роля на ANGPTL4 за увеличаване на траекторията на TG на майчината кръв по време на бременност. Забележителното намаляване на концентрациите на TG в майчината кръв в майките на ppHF показва, че затлъстяването уврежда нарастването на траекторията на TG в майчината кръв по време на бременност при мишки. Нашите настоящи проучвания допълнително демонстрират, че намаляването на експресията на ANGPTL4 служи като основен механизъм на траекторията на TG на майчината кръв с нарушено затлъстяване.

ANGPTL4 е най-мощният инхибитор на LPL сред семейството на ANGPTL (16–22). ANGPTL4 генна мутация или индуцирана от нокаут хипотриглицеридемия (17,51). Въпреки че не измерихме нивата на ANGPTL4 в кръвта в кръвта поради липсата на специфично антитяло, значителното намаляване на експресията на Angptl4 и TG в майчината кръв в майки, хранени с ppHD, потвърждава инхибиторния ефект на ANGPTL4 върху LPL. Възстановяването на концентрациите на TG в майчината кръв в майки чрез ектопична свръхекспресия на ANGPTL4 допълнително потвърждава причинно-следствената роля на намалената експресия на Angptl4 при намалени затлъстявания концентрации на TG в майчината кръв. Въпреки че ANGPTL4 може да действа като ендокринен фактор, проучване съобщава, че ANGPTL4 инхибира LPL дейностите и по паракринен начин (19). Нашият подход за свръхекспресия използва ендокринната характеристика на този протеин. Необходими са бъдещи проучвания, за да се изследва дали ANGPTL4 действа паракринно или системно, за да увеличи концентрациите на TG при майката. Например, както ppHF, така и HF храненето по време на бременност увеличават експресията на гена LPL в плацентите (15) (допълнителна фигура 2C). Ще бъде интересно да се знае дали намаленият майчински ANGPTL4 също допринася за повишена активност на LPL в плацентата чрез ендокринен ефект.

В обобщение, това проучване показва, че затлъстяването уврежда повишаването на концентрацията на TG в майчината кръв по време на бременност при мишки. ANGPTL4 играе решаваща роля за повишаване на концентрацията на TG в майчината кръв. Затлъстяването намалява експресията на ANGPTL4, което води до намаляване на TG траекторията на майчината кръв при затлъстели мишки.

Информация за статия

Благодарности. Авторите благодарят на д-р Рен Джанг (Медицински факултет на държавния университет Уейн, Детройт, Мичиган) за консултации.

Финансиране. Тази работа беше подкрепена от Националния институт по здравеопазване (NIH) Национален институт за сърце, бял дроб и кръв HL-130146 (за BSJD), Национален институт по диабет и храносмилателни и бъбречни болести NIH DK-095132 (за JS) и DK- 113007 (на JS) и Американската фондация за изследване на диабета предоставят 1-16-IBS-272 (на JS).

Двойственост на интересите. Не са докладвани потенциални конфликти на интереси, свързани с тази статия.