Допринесе еднакво за тази работа с: Meiling Su, Wendong Huang

zicao

Отделение по фармакология, Център за сърдечни и церебрални съдове, Медицински факултет Zhongshan, Университет Sun Yat-sen, Гуанджоу, Китай

Допринесе еднакво за тази работа с: Meiling Su, Wendong Huang

Отделение по фармакология, Център за сърдечни и церебрални съдове, Медицински факултет Zhongshan, Университет Sun Yat-sen, Гуанджоу, Китай

Отдел по фармакология, Център за сърдечни и церебрални съдове, Медицински факултет Zhongshan, Университет Sun Yat-sen, Гуанджоу, Китай

  • Мейлинг Су,
  • Wendong Huang,
  • Banghao Zhu

Фигури

Резюме

Цитат: Su M, Huang W, Zhu B (2016) Ацетилшиконин от Zicao предотвратява затлъстяването при плъхове при диета с високо съдържание на мазнини, като инхибира натрупването на липиди и предизвиква липолиза. PLoS ONE 11 (1): e0146884. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0146884

Редактор: Анна Алиси, детска болница „Бамбино Гесе“, ИТАЛИЯ

Получено: 24 юни 2015 г .; Прието: 24 декември 2015 г .; Публикувано: 15 януари 2016 г.

Наличност на данни: Всички съответни данни са в хартията.

Финансиране: Това проучване беше подкрепено от безвъзмездни средства от Съвместния проект на Министерството на националното образование и провинция Гуангдонг (№ 2007B090400089) и (2007A032702001). Финансистите не са играли роля в дизайна на проучването, събирането и анализа на данни, решението за публикуване или подготовката на ръкописа.

Конкуриращи се интереси: Авторите са декларирали, че не съществуват конкуриращи се интереси.

Въведение

Различни лекарства против затлъстяване, включително орлистат, лоркасерин и фентермин/топирамат с удължено освобождаване и налтрексон/бупропион са одобрени от Американската администрация по храните и лекарствата за хронично управление на теглото при възрастни със затлъстяване [9]. Въпреки че са клинично ефективни, тези лекарства имат странични ефекти като стомашно-чревни заболявания, астения, психични разстройства или сърдечно-съдови ефекти [10]. Ето защо е желателно ефективно, но нетоксично лекарство против затлъстяване от естествени източници. Ацетилшиконинът (AS) и неговият екстракт са получени от традиционната китайска медицина Zicao с чистота съответно 98,4% и> 80%, както е установено чрез високоефективна течна хроматография. Zicao е широкоспектърно съединение с противовъзпалителни, антитуморигенни, антибактериални, антивирусни и лечебни свойства на рани [11, 12, 13, 14]. Zicao и shikonin са били използвани за лечение на затлъстяване [15, 16, 17]; последното е предложено да инхибира натрупването на мазнини в адипоцитите на 3T3-L1 [18].

Съществуващите лекарства против затлъстяване функционират чрез индуциране на апоптоза на адипоцитите, инхибиране на натрупването на липиди и стимулиране на липолиза [19] чрез насочване към различни молекули. Активираният от пероксизомен пролифератор рецептор (PPAR) γ и CCAAT/свързващ протеин (C/EBP) α са ключови транскрипционни фактори по време на диференциацията на адипоцитите [20]; Доказано е, че шиконинът предотвратява натрупването на липиди, като инхибира тяхната експресия [16, 18]. Метаболизиращите липиди ензими като хормоночувствителна липаза (HSL) и мастна TG липаза (ATGL) са ключови регулатори на липолизата, които действат чрез хидролизиране на вътреклетъчен триацилглицерол и диацилглицерол за освобождаване на NEFA и глицерол [21]. HSL фосфорилирането се медиира от PKA сигналната каскада и неговото активиране увеличава TG липолизата в адипоцитите [22]. ATGL показва висока субстратна специфичност за триацилглицерол и много нисък афинитет към диацилглицерол при липолиза [23]. Следователно, HSL, ATGL и перилипин са от съществено значение за катехоламин-стимулирана липолиза [24, 25]. Въпреки това остава неясно дали AS има подобни ефекти върху липидния метаболизъм и следователно върху затлъстяването. Настоящото проучване разглежда този въпрос, като оценява ефекта на затлъстяване на AS и свързаните с него механизми в модел на затлъстяване при плъхове, предизвикан от диета с високо съдържание на мазнини (HFD).

Резултати

AS Extract намалява затлъстяването, предизвикано от HFD при плъхове

Плъховете бяха разделени на пет групи: нормална диета (нормален контрол); HFD без лечение (HFD модел); и HFD с лечение с екстракт от AS при 100, 300 и 900 mg/kg (съответно ниски, средни и високи дози). Съотношението на хранителната ефективност и телесното тегло на групата с HFD модел са увеличени съответно с 30,6% и 49,3% спрямо нормалните контроли (P 0,05) (Фиг. 1А); съотношението на ефективност на храната обаче е по-ниско при плъхове, третирани с екстракт от AS [10,0% ± 0,14% (ниска доза), 7,8% ± 0,18% (средна доза) и 8,5% ± 0,23% (висока доза) спрямо 12,8% ± 0,23 % (HFD модел); P Фиг. 1. AS екстракт намалява затлъстяването, предизвикано от HFD при плъхове.

Плъховете бяха разделени на случаен принцип в пет групи: нормален контрол, HFD модел и HFD с екстракт от AS (100, 300 или 900 mg/kg). Екстрактът се прилага интрагастрално в продължение на 6 седмици. (A) Приемът на храна на плъх се записва шест пъти седмично. (Б.) Съотношението на хранителната ефективност се изчислява като увеличаване на телесното тегло, разделено на приема на храна. (° С) Промяната в телесното тегло се измерва шест пъти седмично. (д) Наддаването на телесно тегло, измерено през дадена седмица, се изважда от теглото през предходната седмица. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE (n = 30). Наблюдавани са значителни разлики между нормалните и HFD групите. * P # P ## P ### P Фиг. 2. Екстрактът AS намалява теглото на мастната тъкан, размера на белите адипоцити и натрупването на черен дроб при плъхове със затлъстяване.

Коефициенти на (A) епидидимална мастна тъкан и (Б.) черният дроб се изчислява, след като плъховете са гладували в продължение на 12 часа в края на експеримента, съгласно следното уравнение: коефициент = тъкан (g/плъх)/тегло (g/плъх). (° С) Епидидимална мастна тъкан и (д) черният дроб се оцветява с хематоксилин и еозин за хистопатологично изследване. Изображенията са получени при увеличение 400 пъти при светлинна микроскопия. Стойностите се изразяват като средна стойност ± SE (n = 6). Наблюдавани са значителни разлики между нормалните и HFD групите. * P # P ## P ### P Таблица 1. Ефект на ацетилшиконин върху биохимичните параметри на серума при плъхове, индуцирани от HFD.

AS инхибира диференциацията и натрупването на мазнини в преадипоцитните клетки

Жизнеспособността на 3T3-L1 клетки, инкубирани с различни концентрации на AS в продължение на 24 h, се оценява с помощта на 3- (4,5-диметилтиазол-2-ил) -2,5-идифенил тетразолиев бромид (MTT). Лечението с AS при концентрации, вариращи от 0,005 до 5 μM, няма ефект върху жизнеспособността (P> 0,05; n = 6) (Фигура 3А). Оцветяването на напълно диференцирани адипоцити с Oil Red O разкри, че диференциацията на адипоцитите и натрупването на липиди са потиснати в зависимост от дозата в присъствието на AS (P Фиг. 3. AS инхибира диференциацията на 3T3-L1 преадипоцитите и натрупването на мазнини.

(A) Клетъчната жизнеспособност беше оценена с MTT анализ 24 часа след лечение с AS. (Б.) Относително съдържание на липиди. (° С) Инхибиране на образуването на мастни капчици от AS. 3T3-L1 клетки се засяват и се индуцират да се диференцират в продължение на 8 дни със или без AS в 6-ямкови плаки, след това се оцветяват с Oil Red O и се изобразяват чрез светлинна микроскопия (200 ×). Стойностите се изразяват като средна стойност ± SEM. Наблюдават се значителни разлики между нетретираните и диференцираните контролни клетки. * P # P ## P ### P Фиг. 4. AS инхибира експресията на PPARy, C/EBPα, HSL и ATGL в адипоцитите.

Нивата на протеини се оценяват чрез Western blot в 3T3-L1 клетки, култивирани в продължение на 0, 2, 4 и 7 дни в присъствието или отсъствието на 1,5 μM AS по време на адипогенезата. Имуноблотите са представителни за пет независими експеримента; β-актинът служи за контрол на натоварването. * P Фиг. 5. AS индуцира липолиза в зрели адипоцити.

Зрелите 3T3-L1 клетки се инкубират с различни концентрации на AS (0, 0.5, 1.5 и 4.5 μM) в продължение на 24 часа. Стойностите се изразяват като средно количество (± SE) освободен глицерол за кладенче като процент от контролната стойност. Бяха направени четири повторения за всяко лечение. Средствата, обозначени с различна буква, са значително различни (P Фиг. 6. AS индуцира липолиза в зрели адипоцити чрез активиране на фосфорилирането и активността на PKA и HSL.

Напълно диференцирани 3T3-L1 адипоцити бяха инкубирани в отсъствие и присъствие на различни концентрации на AS (0, 0.5, 1.5 и 4.5 μM) в продължение на 3 часа. Имуноблотите са представителни за седем независими експеримента; β-актинът служи за контрол на натоварването. * P 3-кратно повишаване на нивата на липидите в кръвта и бяха разпределени на случаен принцип към една от четирите групи (n = 6 всяка): HFD модел (нелекуван) и HFD, третиран с ниски (100 mg/kg), средни (300 mg/kg) ) или високи (900 mg/kg) дози AS. Нормалните контролни плъхове са хранени със стандартна диета, докато HFD се състои от 10% свинска мас, 1,25% холестерол, 0,5% жлъчни соли, 10% яйчен жълтък на прах и 78,75% стандартна диета. Носител (дестилирана вода) или екстракт от AS се прилага интрагастрално в продължение на 6 седмици на HFD плъхове. Теглото на тялото и приемът на храна се записват шест пъти седмично.

Биохимичен анализ

Плъховете се упояват и се жертват след 12-часов пост в края на експеримента. Кръв се събира от коремната куха вена и се центрофугира при 3000 rpm в продължение на 15 минути при стайна температура. Нивата на серумен триглицерид (TG), общ холестерол, липопротеин с висока плътност (HDL), холестерол на липопротеини с ниска плътност (LDL) и свободни мастни киселини (FFA) са измерени с автоматичен биохимичен анализатор Model 7180 (Hitachi, Токио, Япония).

Хистологичен анализ

Бялата мастна тъкан (епидидимис) и черният дроб се дисектират от плъхове и веднага се претеглят и фиксират в 10% разтвор на формалин за 1 ден. След дехидратация в етанол тъканта се вгражда в парафин и се нарязва на участъци с дебелина 5 μm, които се оцветяват с хематоксилин и еозин. Срезите са изобразени на инвертиран светлинен микроскоп IX71 (Олимп, Токио, Япония) при увеличение 200 ×.

Клетъчна култура и диференциация

Преадипоцитите на мишки фибробласти 3T3-L1 са закупени от American Type Culture Collection (Manassas, VA, USA) и са култивирани в DMEM с високо съдържание на глюкоза, съдържащ 10% телешки серум, пеницилин (100 U/ml) и стрептомицин (100 μg/ml) в атмосфера от 5% CO2 и при 37 ° C. Средата се сменяше три пъти седмично. Клетките се отглеждат до сливане в 6-ямкови плаки и се предизвиква диференциация чрез добавяне на адипогенен коктейл, съдържащ 0,5 mM IBMX, 0,5 mM DEX и 10 mg/l инсулин в DMEM с високо съдържание на глюкоза с 10% фетален говежди серум (FBS) за 2 дни. След това средата беше заместена с DMEM с 10% FBS и 10 mg/l инсулин за още 2 дни, след което средата беше заменена с DMEM, съдържаща 10% FBS на всеки 2 дни, докато около 95% от култивираните преадипоцити се диференцираха в зрели адипоцити. За да се оцени ефектът от AS върху диференциацията на адипоцитите, сливащите се 3T3-L1 преадипоцити се третират с 0, 0.5, 1.5 или 4.5 μM AS в присъствието на адипогенния коктейл в продължение на 7 дни.

Анализ на клетъчната жизнеспособност

Жизнеспособността на 3T3-L1 клетки е оценена с MTT анализ, както е описано по-рано [22]. Клетките се отглеждат в 96-ямкови плаки с плътност 2 × 104 клетки/ямка. След залепване за една нощ, клетките се стимулират с AS в различни концентрации (0,005, 0,05, 0,5 или 5 в DMSO). Контролната група се третира с DMEM с 10% FBS и 0,1% DMSO. След инкубация в продължение на 24 часа при 37 ° С в 5% СО2, клетките се измиват три пъти с буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS). МТТ реагент (10 μl от разтвор от 1 mg/ml) и среда (100 μl) се добавят към всяка ямка, последвано от инкубация на тъмно при 37 ° С в продължение на 4 часа. Кристалите на Формазан бяха разтворени с DMSO и абсорбцията при 570 nm беше измерена на Elx-800 четец за микроплаки (BioTek, Winooski, VT, САЩ).

Маслено червено оцветяване и количествено определяне на клетките

Оцветяването с маслено червено O се извършва по предварително описан метод [44]. 3T3-L1 клетки бяха индуцирани да се диференцират, както е описано по-горе, измити три пъти с PBS, фиксирани с 10% формалин в продължение на 1 h, след това оцветени с Oil Red O (0.5% в 60% изопропанол) в продължение на 30 минути. Адипоцитите се промиват със 70% етанол във вода и след това се сушат на въздух. Оцветените клетки се визуализират чрез светлинна микроскопия и се изобразяват при увеличение 200 пъти. Масленочервени О-оцветени липиди се разтварят със 100% изопропанол и абсорбцията при 490 nm се определя със спектрофотометър.

Анализ на липолиза

Напълно диференцираните адипоцити (т.е. ден 8) бяха лишени от серум за една нощ в безфенолна червена среда, съдържаща 2% говежди серумен албумин и третирани с AS (0, 0.5, 1.5 или 4.5 μM) или оставени без лечение в продължение на 24 часа. В края на експеримента 100 μl среда се отстранява от всяка ямка и се прехвърля в 96-ямкова плака за оценка на нивата на глицерол. Реагентът от комплекта за анализ се добавя към всяка ямка и се инкубира при 37 ° С в продължение на 10 минути и абсорбцията при 570 nm се отчита с четец на микроплаки.

Анализ на Western Blot

Общият протеин от клетките се екстрахира с лизисен буфер, съдържащ протеаза и/или фосфатазен инхибитор коктейл. Количествената концентрация на протеини се определя с комплект бицинхонинова киселина. Протеините се разделят с 8% електрофореза на полиакриламиден гел на натриев додецил сулфат и след това се прехвърлят в мембрана от поливинилиден дифлуорид (Millipore, Billerica, МА, САЩ), която се блокира с 5% обезмаслено сухо мляко в буфериран с Tris физиологичен разтвор с Tween 20 ( TBST; 20 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, 0,1% Tween 20, рН 7,5) за 1 h. След това мембраната се инкубира през нощта при 4 ° С с първични антитела срещу следните протеини: PPARy, C/EBPα и HSL (1: 1000); ATGL, фосфо-HSL (Ser563) и фосфо-PKA (1: 1000). След трикратно измиване с TBST, мембраните се инкубират с HRP-конюгиран кози анти-заешки IgG (1: 1000) в продължение на 1,5 часа. За контрол на натоварването се използва β-актиново антитяло (1: 3000; технология за клетъчна сигнализация). Протеините бяха открити чрез засилена хемилуминесценция (Beyotime, Шанхай, Китай).

Статистически анализ