Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

активирането

Отделение по кардиология, Отделение по вътрешни болести, болница Tongji, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Wuhan, Китай

Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Кореспонденция Ping Song, Център за молекулярна и транслационна медицина, Държавен университет в Джорджия, 157 Decatur Street SE, Атланта, GA 30303, САЩ. E-mail: [email protected] Потърсете още статии от този автор

Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Център за молекулярна и транслационна медицина, Държавен университет в Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Отделение по кардиология, Отделение по вътрешни болести, болница Tongji, Медицински колеж Tongji, Университет за наука и технологии Huazhong, Wuhan, Китай

Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Кореспонденция Ping Song, Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на Джорджия, 157 Decatur Street SE, Атланта, GA 30303, САЩ. E-mail: [email protected] Потърсете още статии от този автор

Център за молекулярна и транслационна медицина, Университет на щата Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Център за молекулярна и транслационна медицина, Държавен университет в Джорджия, Атланта, Джорджия, САЩ

Резюме

Предистория и цел

Съобщава се, че метформинът, едно от най-често предписваните лекарства за диабет тип 2, има понижаващи АН ефекти при пациенти с диабет. Въпреки това, ефектите и основните механизми на метформин върху АН при недиабетни състояния трябва да бъдат определени. Целта на настоящото проучване беше да се определят ефектите на метформин върху хипертония, предизвикана от инфузия на ангиотензин II (Ang II) in vivo.

Експериментален подход

Ефектите на метформин върху BP са изследвани при мишки от див тип (WT) C57BL/6J и при мишки без липса на активирана от AMP протеин киназа α2 (AMPKα2) мишки със или без инфузия на Ang II. Също така, ефектът на метформин върху индуцирания от Ang II ендоплазмен ретикулум (ER) стрес е изследван в култивирани човешки съдови гладкомускулни клетки (hVSMC).

Ключови резултати

Метформин значително намалява BP при инфузирани с Ang II WT мишки, но не и при мишки с дефицит на AMPKα2. При култивирани hVSMCs, лечението с Ang II води до инактивиране на AMPK, както и последващо индуциране на срастващ се X-box свързващ протеин-1, фосфорилиране на еукариотния фактор за иницииране на транслация 2α и експресия на регулиран от глюкоза протеин 78 kDa, представляващ три добре характеризирани ER маркери за стрес. Нещо повече, AMPK активирането от метформин намалява предизвикания от Ang II ER стрес в hVSMCs. Механично, активираният от метформин AMPKα2 потиска ER стреса чрез увеличаване на фосфоламбан фосфорилирането.

Заключение и последици

Метформин облекчава задействаната от Ang II хипертония при мишки чрез активиране на AMPKα2, който медиира фосфоламбановото фосфорилиране и инхибира индуцирания от Ang II стрес в съдовите клетки на гладката мускулатура.

Съкращения

Въведение

АМР-активираната протеинкиназа (AMPK) е централен регулатор на клетъчния метаболизъм и редокс баланса в тъканите на бозайници (Song и Zou, 2012). Съдовият AMPK комплекс се състои от три субединици, α, β и γ субединици (Song и Zou, 2012). Недостигът на AMPKα2 причинява аберрантен ER стрес в ендотелните клетки, което води до ендотелна дисфункция и ускорена атерогенеза при западните мишки с аполипопротеин Е, хранени с диета (Dong и др., 2010а). Активирането на AMPK инхибира LDL-задействания ER стрес в ендотел инвитро и при мишки in vivo (Донг и др., 2010б). Нещо повече, изтриването на AMPKα2 води до отклоняващ се ER стрес в VSMCs и последващ висок BP (Liang и др., 2013), потвърждавайки схващането, че AMPKα2 и неговото физиологично потискане на ER стрес са от съществено значение за поддържане на нормален съдов тонус.

Публикувана работа от нас и други показва, че метформин упражнява терапевтичните си ефекти чрез активиране на AMPK (Zheng и др., 2013; Чо и др., 2015). Метформин потиска индуцирания от палмитат ER стрес в клетките на инсулинома от плъх (Simon-Szabo и др., 2014), а също така възстановява ендотелната функция при затлъстели мишки, предизвикани от диета с високо съдържание на мазнини, чрез притъпяване на ER стрес (Cheang и др., 2014). Инхибирането на AMPK води до прекомерен ER стрес в сънните артерии на спонтанно хипертонични плъхове (Liu и др., 2015), докато активирането на AMPK от 5-аминоимидазол-4-карбоксамид рибонуклеотид (AICAR) пеенол или берберин потиска ER стреса в аортите на мишката и каротидните артерии на плъх (Liang и др., 2013; Лиу и др., 2015 г .; Чой и др., 2016). Въз основа на сегашното ни разбиране за хипертония, предизвикана от инфузия на Ang II, ние се опитахме да определим дали подтиснатият с AMPK ER стрес е необходим за понижаващите АН ефекти на метформин. Тук съобщаваме, че индуцираният от Ang II отклонен ER стрес при VSMCs допринася за повишаване на BP и че метформинът действа чрез AMPKα2 индуцирано от активирането потискане на ER стреса в VSMCs до по-нисък Ang II-индуциран висок BP при мишки.

Методи

Животни

Всички грижи за животните и експериментални процедури са одобрени от Институционалния комитет за грижи и употреба на животните на Държавния университет в Джорджия. Отчитат се проучвания върху животни в съответствие с насоките ARRIVE (Kilkenny и др., 2010; McGrath and Lilley, 2015). Мишки с дефицит на AMPKα1 (AMPKα1 -/-) или AMPKα2 (AMPKα2 -/-) са генерирани, както е описано от Йоргенсен и др., (2004). Мишки от див тип (WT) C57BL/6J, AMPKα1 -/- и AMPKα2 -/- (на възраст 10–12 седмици) + бяха обезболени и след това имплантирани с осмотични минипомпи, съдържащи Ang II или носител под кожата на гърба на мишките, както е описано по-рано (Wu и др., 2015). Мишките бяха непрекъснато инфузирани с Ang II (0.8 μg · g -1 ден дневен -1, 14 дни) или носител (физиологичен разтвор). На същия ден половината от мишките са лекувани с метформин (300 mg · kg -1 телесно тегло на ден в питейна вода) или AICAR (500 mg · kg -1 телесно тегло, една ip инжекция на ден в продължение на 14 дни, физиологичен разтвор като превозно средство). BP се измерва, използвайки както метода на каротидния катетър, така и техниката на радиотелеметрия, описана по-горе (Liang и др., 2013 ). Мишките бяха настанени в контролирани от температурата клетки под 12-часов цикъл светлина-тъмнина и им беше предоставен свободен достъп до вода и редовна диета за гризачи.

Клетъчна култура

Човешки VSMCs (hVSMCs) (ThermoFisher Scientific, Waltham, MA, USA) се култивират в среда M231 (Cascade Biologics, Portland, OR, USA), допълнена с 10% FBS, пеницилин (100 U · mL -1) и стрептомицин (100 μg · ML -1). Всички клетки бяха инкубирани при 37 ° С във влажна атмосфера от 5% СО2 и 95% въздух. Клетките бяха отгледани до 70–80% сливане, преди да бъдат третирани с различните агенти.

Western blot анализ

Клетъчните лизати се подлагат на Western blot анализ, както е описано по-горе (Song и др., 2009). Съдържанието на протеин се анализира с помощта на реагент за анализ на протеин BCA (Pierce Chemical Co., Rockford, IL, USA). Протеините (20 μg) се разделят чрез SDS-PAGE и след това се прехвърлят в мембрана. Мембраната се инкубира с разреждане на първично антитяло 1: 1000, последвано от разреждане на конюгирано вторично антитяло от хрян пероксидаза 1: 5000. Протеиновите ленти бяха визуализирани с повишена хемилуминесценция (ECL) (Pierce Chemical Co.).

Имунохистохимия

Аортата на мишката и мезентериалната артерия бяха дисектирани, фиксирани в 4% параформалдехид за 24 часа и вградени в парафин. Секциите бяха депарафинизирани, рехидратирани и микровълнови в цитратен буфер за извличане на антиген. Секциите бяха инкубирани последователно в ендогенен пероксидазен и алкален фосфатазен блоков буфер (Dako, Glostrup, Дания), протеинов блок буфер и първични антитела, които бяха инкубирани със секциите за една нощ при 4 ° С. След изплакване в измиващ буфер срезовете бяха инкубирани с белязани полимер-хрянова пероксидаза анти-миши или заешки антитела и 3,3'-диаминобензидин (DAB) хромоген, както е описано по-горе (Ding и др., 2016). След последно измиване срезите бяха оцветени с хематоксилин.

Данни и статистически анализ

Данните и статистическият анализ в това проучване са в съответствие с препоръките за експериментално проектиране и анализ във фармакологията (Curtis и др., 2015). Данните са изразени като средни стойности ± SD. Нормалността на разпределението беше оценена със софтуера за анализ GraphPad Prism 5 (La Jolla, CA, USA) и беше установено, че всички данни са нормално разпределени. Различията между групите бяха оценени за значителни разлики, използвайки тези на Student т- тест за несдвоени данни или еднопосочен ANOVA с Bonferroni's post hoc тест. Всички останали резултати бяха анализирани с помощта на двустранен студент т‐ Тест за сравнение между две групи. Стойности на P

Материали

Антитела срещу общ AMPKα, AMPKα1, AMPKα2, фосфо-AMPKα (T172; 40H9, 2535), фактор за иницииране на транслация на фосфо-еукариот 2α (eIF2α) и фосфо-фосфоламбан (S16/T17; 8496) са получени от Cell Signaling Technology (Danvers, Cell Signaling Technology). MA, САЩ). Антитела срещу снаден X-box свързващ протеин-1 (XBP1s) са получени от Biolegend (Сан Диего, Калифорния, САЩ). Антитела срещу Lys-Asp-Glu-Leu (KDEL) са получени от Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY). Антитела срещу фосфоламбан (PLB) са получени от Santa Cruz Biotechnology, Inc. (Santa Cruz, CA). Осмотичните минипомпи са закупени от Alzet (Пало Алто, Калифорния, САЩ). Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) и съединение C са от Calbiochem (San Diego, CA, USA). AICAR е закупен от Toronto Research Chemicals, Inc. (Торонто, Канада). Всички други химикали, освен ако не е посочено друго, са закупени от Sigma-Aldrich (Сейнт Луис, Мисури).

Номенклатура на мишени и лиганди

Ключовите протеинови цели и лиганди в тази статия са хипервръзки към съответните записи в http://www.guidetopharmacology.org, общия портал за данни от IUPHAR/BPS Ръководство за ФАРМАКОЛОГИЯ (Southan и др., 2016) и са трайно архивирани в Краткото ръководство за ФАРМАКОЛОГИЯ 2015/16 (Александър и др., 2015а, б).

Резултати

Метформин намалява индуцираната от Ang II хипертония при мишки C57BL/6J

Моделът на индуцирана от Ang II хипертония възпроизвежда ключови характеристики на човешката есенциална хипертония (Te Riet и др., 2015). Първо оценихме ефекта от инфузията на Ang II (0,8 μg · g -1 ден на -1 за 14 дни) върху систоличния (sBP) и диастоличния BP (dBP) при мишки. В съответствие с предишни доклади (Liang и др., 2013), вливането на Ang II предизвика значително увеличение както на sBP, така и на dBP при възрастни мишки C57BL/6J от див тип (WT) в сравнение с инфузията с носител (физиологичен разтвор) (Фигура 1A-C). Интересното е, че лечението с метформин не променя BP при инфузирани с превозни средства мишки, но намалява sBP и dBP при инфузирани с Ang II мишки.

Ang II предизвиква ER стрес при мишки и hVSMCs

Метформинът елиминира предизвикания от Ang II ER стрес в hVSMCs

AMPK инактивирането предизвиква ER стрес в hVSMCs

След това тествахме ефекта от инактивирането на AMPK върху ER стрес. Съединение С, широко използван инхибитор на AMPK (Jin и др., 2009), ясно повиши нивата на ER маркерите за стрес и допълнително засили Ang II-медиирания ER стрес в hVSMCs (Фигура 4A, B). Нокдаунът на AMPKα1 в hVSMCs от специфична за AMPKα1 siRNA доведе до умерено увеличаване на ER стреса. Въпреки това, AMPKα2 нокдаун от AMPKα2-специфична siRNA подчертано индуцира ER стрес, както е показано чрез повишена експресия на p-eIF2α, протеин дисулфид изомераза и XBP1s, в сравнение с нивата след лечение с разбъркани siRNA (Фигура 4C). Освен това, ER стресът при VSMCs, изолирани от AMPKα2 -/- мишки, е по-голям от този при VSMCs, изолирани от AMPKα1 -/- или WT мишки (Фигура 4D). Тези резултати предполагат, че AMPKα2 е критичната изоформа на AMPKα, която регулира ER стреса при VSMC и че AMPKα2 играе по-важна роля от AMPKα1 при регулирането на индуцирана от Ang II хипертония при мишки.

Инхибирането на предизвикания от Ang II ER стрес от метформин зависи от AMPKα2

След това изследвахме дали защитният механизъм на метформин зависи от AMPKα2. Както е показано на Фигура 4Е, AMPKα2 siRNA, но не и кодирана siRNA, води до ER стрес в hVSMCs, в съгласие с наблюдения в AMPKα2 -/- mVSMCs (Liang и др., 2013 ). Освен това, метформинът подобрява индуцирания от Ang II ER стрес в трансформирани hVSMCs, трансфектирани с siRNA, но не и в hVSMCs, трансфектирани с siPNA с AMPKα2 (Фигура 4Е), което предполага, че AMPKα2 е необходим за облекчаване на метформин от индуциран от Ang II ER стрес.

PLB фосфорилирането е необходимо за инхибиране на метформин на ER II-индуциран ER стрес

Повишаването на вътреклетъчния Ca 2+ е често срещан механизъм, участващ в отклоняващо се активиране на ER стрес и такива промени на вътреклетъчния Ca 2+ се регулират чрез активността на саркоплазматична/ER Ca 2+ - ATPase (SERCA) (Dong и др., 2010а). PLB в своята нефосфорилирана форма взаимодейства със SERCA и инхибира неговата активност (Chen и др., 2007); обаче, при фосфорилиране на PLB, SERCA функционира нормално и поддържа нивата на ER Ca 2+ (Koss и Kranias, 1996). Следователно, ние след това изследвахме значението на PLB за инхибирането от метформин на Ang II-медииран ER стрес. Ang II зависимо от дозата намалява фосфорилирането на PLB, но не влияе върху общите нива на PLB протеин (Фигура 5А), докато метформин възстановява PLB фосфорилирането, което е притъпено от лечението с Ang II (Фигура 5B). Освен това, заглушаването на AMPKα2 блокира индуцираното от метформин инхибиране на нарушеното от Ang II фосфорилиране на PLB (Фигура 5С). Освен това, метформин потиска предизвикания от Ang II ER стрес в контрола, разбъркани hVSMC, трансфектирани с siRNA, но не и в hVSMC, трансфектирани с PLB siRNA (Фигура 5D), което показва, че PLB е необходим за потискане на зависимия от Ang II стрес от метформин.

AMPKα2 е необходим за облекчаване на метформин при индуцирана от Ang II хипертония при мишки

В съответствие с предишни доклади (Wang и др., 2011; Лианг и др., 2013), sBP, dBP и средният BP (mBP) при AMPKα2 -/- мишки са били по-високи от тези при WT мишки при базови условия (Фигура 6A-C). Само лечението с метформин не променя АН нито при WT, нито при AMPKα2 -/- мишки при нормални условия (Фигура 6А-С). Вливането на Ang II значително повишава BP (sBP, dBP и mBP) както при WT, така и при AMPKα2 -/- мишки в сравнение с лечението с носител (Фигура 6A-C). Важното е, че лечението с метформин облекчава индуцираното от Ang II повишаване на sBP, dBP и mBP при WT мишки, но не и при AMPK α2 -/- мишки (Фигура 6A-C), което показва, че AMPKα2 наистина е от съществено значение за облекчаване на метформин при индуциран от Ang II висок BP. Интересното е, че AICAR, неселективен AMPK активатор (Zhang и др., 2009a), значително намалена индуцирана от Ang II висока sBP и при WT, и при AMPKα2 -/- мишки, въпреки че AICAR не променя sBP и при WT, и при AMPKα2 -/- мишки при нормални условия (Фигура 6D).

Дискусия

В настоящото проучване демонстрирахме, че индуцираният от Ang II отклонен ER стрес при VSMCs допринася за повишаване на BP и че метформинът понижава този Ang II-индуциран висок BP чрез AMPKα2 индуцирано от активирането потискане на ER стреса в VSMC при мишки. Механично, метформин-медиираното активиране на AMPK насърчава фосфорилирането на PLB, което в крайна сметка възстановява клетъчната калциева хомеостаза, медиирано от SERCA активиране, инхибира ER стреса и облекчава индуцираната от Ang II хипертония при мишки (Фигура 6Е).

PLB е основният физиологичен инхибитор на SERCA (Koss и Kranias, 1996), а фосфорилирането на PLB при Ser 16 или Thr 17 подобрява функцията на SERCA за поддържане на нивата на калций в ER чрез намаляване на ефикасността на PLB-медиирано инхибиране (Traister и др., 2014). Наскоро се съобщава, че метформин засилва разграждането на PLB чрез автофагия в кардиомиоцитите, упражнявайки защитна функция в сърцата (Teng и др., 2015). Освен това, активирането на AMPK от A769662 увеличава фосфорилирането на PLB при Thr 17 в обединени бедрени артерии (Schneider и др., 2015). В съгласие с тези по-ранни данни, ние демонстрирахме, че лечението на hVSMCs с Ang II намалява нивото на фосфорилиран PLB. Изоформата AMPKα2 във VSMC е необходима за метформин, за да блокира инхибирането, от Ang II, на фосфорилирането на PLB. Дали обаче AMPKα2 директно или индиректно фосфорилира PLB, е необходимо допълнително проучване.

Остава да се определи дали други механизми участват в ефектите на метформин върху понижаването на АТ при хората. Например, метформин предотвратява хипертонията при спонтанно хипертонични плъхове чрез намаляване на нивата на асиметричен диметиларгинин (Tsai и др., 2014). Метформин намалява активността на NAD (P) H оксидазата в мишите подоцити, което води до намаляване на оксидативния стрес (Piwkowska и др., 2010). Метформин възстановява ендотелната функция, инхибирана от промени в нивата на глюкозата, чрез AMPK-зависимо eNOS възстановяване и намаляване на p47-phox, субединица на NADPH оксидаза (An и др., 2016). Такова намаляване на оксидативния стрес и възстановяване на ендотелната функция допринасят за намаленото АН при индуцирани от стрептозотоцин диабетни плъхове (Majithiya и Balaraman, 2006). В допълнение, метформин намалява Ang II-повишения АТ при мишки, което може да възникне чрез индукция на екскреция на натрий в урината (Deji и др., 2012). Алтернативно, метформин може да упражнява тези ефекти чрез индукция на ER стрес в раковите клетки на простатата (Yang и др., 2015а). Следователно по-нататъшното разследване на тези механизми е оправдано в светлината на нашите констатации.

В обобщение, нашите резултати показват, че анормалният ER стрес е съпътствал развитието на Ang II-медииран, висок BP. Метформин инхибира предизвикания от Ang II ER стрес чрез AMPKα2 – PLB-SERCA път и този път може да осигури нова терапевтична цел за лечение на хипертония.

Благодарности

Това проучване беше подкрепено от безвъзмездни средства от Националните здравни институти (HL079584, HL080499, HL089220, HL110488, HL128014, HL132500, AG047776 и CA213022). Тази работа беше частично подкрепена от Изследователския алианс на Грузия. Д-р Zou е известен стипендиант по молекулярна медицина в Грузия.