Д-р Yuguo Chen и д-р Xiaoxing Li

отслабва

Болница Qilu, Университет Шандонг

107 Wenhua Xi Road, Jinan, Шандонг 250012 (Китай)

Имейл [email protected], [email protected]

Сродни статии за „“

  • Facebook
  • Twitter
  • LinkedIn
  • електронна поща

Резюме

Въведение

Хроничната консумация на диета с високо съдържание на мазнини (HF) води до метаболитен синдром (MS), който се характеризира с редица метаболитни нарушения, включително затлъстяване, нарушен глюкозен толеранс и високи нива на триглицеридите [1]. Затлъстяването, индуцирано от високочестотна диета, е свързано с повишеното генериране на реактивни кислородни форми (ROS), които предизвикват оксидативен стрес в организма [2]. Оксидативният стрес, предизвикан от затлъстяване, причинява сърдечно-съдови усложнения, включително липотоксична кардиомиопатия, която може да се прояви като ремоделиране на миокарда и сърдечна дисфункция [3]. Предишни проучвания показват, че разстройството на глюкозния/липидния метаболизъм и хипертонията допринасят за промени в структурата и функцията на лявата камера [4-6].

Митохондриалната алдехиддехидрогеназа тип 2 (ALDH2) е ключов ензим, участващ в сърдечната защита [7]. Активирането на ALDH2 корелира силно с кардиопротективните ефекти в редица моделни системи [8-10]. ALDH2 се активира от няколко пътища, включително c-Jun N-терминална киназа (JNK)/активиран протеин-1 (AP-1) път, който играе важна роля в сърдечното ремоделиране и клетъчната апоптоза [11, 12]. JNK регулира активността на многобройни митохондриални и ядрени протеини чрез фосфорилиране [13]. По-специално, JNK/AP-1 сигнализиращият път може да улесни инсулиновата резистентност и миокардната хипертрофия, индуцирани от оксидативен стрес [14, 15]. Освен това, инсулиновият рецепторен субстрат 1 (IRS-1) и серин-треонин протеин киназата Akt регулират инсулиновата резистентност и клетъчната апоптоза, свързани с оксидативен стрес [16, 17]. ALDH2 предпазва от сърдечни аномалии при индуцирано от HF затлъстяване чрез механизъм, свързан с регулиране на автофагията и деацетилиране на PGC-1α от SUV39H-Sirt1 [18]. Остава обаче неясно дали ALDH2 регулира JNK/AP-1 или IRS-1/Akt сигнални пътища по време на ремоделиране на миокарда, индуцирано от MS.

В това проучване изследвахме защитната роля на ALDH2 в липотоксичната кардиомиопатия, предизвикана от МС, и изследвахме основния сигнален механизъм. Ние създадохме модел на мишка на MS; ние свръхекспресирахме ALDH2 в този модел, за да определим дали ALDH2 инхибира оксидативния стрес и инсулиновата резистентност и предпазва от сърдечна дисфункция и увреждане на миокардната тъкан, причинени от високочестотна диета. В допълнение, ние изследвахме механизмите на кардиопротекция, свързани с свръхекспресията на ALDH2, с особен акцент върху сигналните пътища JNK/AP-1 и IRS-1/Akt.

Материали и методи

Експериментални животни

Измерване на телесно тегло и серологично изследване

На месечна база се събира венозна кръв след гладуване през нощта. Концентрациите на гладен серумен холестерол, триглицериди (TG), липопротеин-холестерол с ниска плътност (LDL-C), HDL-C, кръвна глюкоза на гладно (FBG) и инсулин на гладно (FINS) бяха оценени в клиничната лаборатория на отделението (болница Qilu свързана с университета Шандонг, Дзинан, Китай). Индексът на инсулинова резистентност (IRI) се изчислява по следната формула: IRI = (FBG × FINS) /22,5, както е описано по-рано [19].

Ехокардиографска оценка

За да се изследва сърдечната структура и функция, мишките се анестезират с 1% изофлуран и се оценяват с помощта на двуизмерна управляема ехокардиография в М-режим на инструмент Vevo 770, оборудван с 30 MHz преобразувател (RMV 707B; Visual Sonics, Торонто, Канада). Краен диастоличен диаметър на лявата камера (LVEDD), краен систоличен диаметър на лявата камера (LVESD), краен диастоличен обем на лявата камера (LVEDV), краен систоличен обем на лявата камера (LVESV), дебелина на междукамерната преграда (IVSd) и задна лява камера дебелината на стената в крайната диастола (LVPWd) са записани от изображенията в М-режим. Фракцията на изтласкване (EF) и фракционното скъсяване (FS) се изчисляват, както следва: EF = (LVEDV – LVESV)/​​LVEDV × l00%; FS = (LVEDD – LVESD)/LVEDD × l00%, както е описано по-горе [20]. Всички ехокардиограми са извършени от един опитен индивид с помощта на ръчна сонда. Параметрите бяха измерени в продължение на пет последователни цикъла.

Хистологично изследване

След анестезия и евтаназия, част от лявата камера се изрязва, изплаква се с буфериран с фосфат физиологичен разтвор (PBS) и се фиксира незабавно в 10% неутрално буфериран формалин. Образците бяха вградени в парафин, нарязани на 5-μm участъци и оцветени с хематоксилин и еозин (HE) и трихром на Masson’s (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). Процентът на синьото оцветяване на Masson беше измерен в 10 произволно избрани полета във всяка секция от три непоследователни серийни секции от всяка мишка. Останалата сърдечна тъкан се замразява при -80 ° C за уестърн блотинг и откриване на ензимна активност на ALDH2.

Трансмисионна електронна микроскопия

Част от миокарда с приблизително 2,5 mm3 се фиксира с 2,0% глутаралдехид за изследване чрез електронна микроскопия. Разрезите бяха изследвани на H-7000FA пропускащ електронен микроскоп (Hitachi Co. Ltd., Токио, Япония).

Измерване на митохондриалната активност на ALDH2

Митохондриалната активност на ALDH2 се измерва при стайна температура в буфер, съдържащ 33 mM натриев пирофосфат, 0.8 mM NAD +, 15 mM пропионалдехид и 50 μg протеин. Субстратът на ALDH2 се окислява до оцетна киселина, докато NAD + се редуцира до NADH. Производството на NADH се определя чрез измерване на абсорбцията при 340 nm. Активността на ALDH2 се изразява като nmol NADH, произведен на минута на mg протеин.

Анализ на терминиране на дезоксинуклеотидил трансфераза, dUTP ник-край, етикетиран чрез медииране

Секции на вентрикуларна тъкан (с дебелина 5 μm) бяха вградени с парафин и инкубирани в разтвор на протеиназа К в продължение на 30 минути. След това срезовете бяха оцветени с терминален дезоксинуклеотидил трансфераза, медииран от dUTP комплект за етикетиране на никел (TUNEL) (Roche, Базел, Швейцария), следвайки протоколите на производителя. Ядрата бяха идентифицирани чрез DAPI оцветяване. TUNEL-положителните клетки бяха преброени с помощта на флуоресцентен микроскоп (Olympus, Токио, Япония) при увеличение 400 пъти и беше изчислен процентът на апоптотичните клетки.

Измерване на потенциала на митохондриалната мембрана

Промените в потенциала на митохондриалната мембрана (ΨΨm) бяха определени с помощта на флуоресцентната сонда JC-1 (Life Technologies, Carlsbad, CA). Пречистените митохондрии се оцветяват с JC-1 при 37 ° С в продължение на 20 минути и се анализират чрез поточна цитометрия (FACSCalibur; BD, Franklin Lakes, NJ) или чрез конфокална микроскопия. Флуоресцентната емисия е измерена при 530 nm за мономерната форма на JC-1 (зелено) и при 590 nm за JC-1 агрегатите (червено). Намаляването на ΔΨm се показва чрез намаляване на флуоресценцията при 590 nm.

Измерване на ROS

Флуоресценцията на дихлордихидрофлуоресцеин диацетат (DCFH-DA) (Life Technologies) се използва за измерване на вътреклетъчната ROS. Кардиомиоцитите бяха инкубирани с 5 mM DCFH-DA в продължение на 20 минути при 37 ° C в балансиран солев разтвор на Ханк, изплакнати с PBS, възстановени в пълната модифицирана среда на Dulbecco модифицирана Eagle и анализирани незабавно с лазерно сканиращ конфокален микроскоп (модел LSM710; Йена, Германия). Интензитетът на флуоресценция е измерен с помощта на софтуера Image-Pro Plus (Media Cybernetics, Atlanta, GA).

Имунохистохимично оцветяване

След обезпарафинирането и рехидратирането на секциите се извършва извличане на антиген в продължение на 15 минути в 1% буфер на лимонена киселина (рН 6,0) при 92–98 ° C. Слайдовете се охлаждат при стайна температура в продължение на 30 минути, изплакват се с PBS и се инкубират в продължение на 20 минути с 5% говежди серумен белтък, за да се блокира неспецифичното свързване. Слайдовете бяха инкубирани с анти-4-хидроксиноненално (4-HNE) антитяло (1: 200; заешка поликлонална анти-мишка; Sigma-Aldrich) за една нощ при 4 ° С и след това инкубирани с биотинилирано анти-заешко IgG вторично антитяло. За откриване на имунохистохимичната реакция е използван комплект DAB субстрат (Vector Laboratories, Burlingame, CA).

Western blot анализ

Протеините се разделят чрез натриев додецил сулфат-полиакриламиден гел електрофореза и се прехвърлят в нитроцелулозни мембрани. Мембраните бяха блокирани с 5% обезмаслено мляко и инкубирани със специфични първични антитела за една нощ при 4 ° С. Антитела срещу p-JNK, IRS-1, p-IRS-1, Akt и p-Akt са закупени от Cell Signaling Technology (Beverly, MA), а антителата срещу ALDH2 и каспаза 3 са получени от Santa Cruz Biotechnology (Santa Cruz, Калифорния). Анти-AP-1 антитяло е закупено от Abcam (Cambridge, MA). Мембраните бяха инкубирани с вторични антитела, свързани с пероксидаза от хрян. Мембраните бяха разработени с помощта на ECL Prime реагенти (GE Healthcare, Piscataway, NJ) и беше открита хемилуминесценция с помощта на луминесцентен анализатор на изображения LAS-4000 (Fujifilm, Stamford, CT, USA). Дензитометричният анализ беше извършен с помощта на софтуера ImageJ (Национален институт по здравеопазване, Bethesda, MA).

PCR в реално време

TRIzol реагентът (Invitrogen) се използва за извличане на обща РНК. Общата концентрация на РНК се определя с помощта на спектрофотометър NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Wilmington, DE). Синтезът на cDNA от първа верига се извършва с използване на произволни праймери и TaqMan реактиви за обратна транскрипция (Applied Biosystems, Foster City, CA). PCR в реално време се извършва с помощта на предварително проектирани комплекти за грундиране TaqMan и Gene Expression Master Mix (Applied Biosystems) в система Prism 7500 (Applied Biosystems), с изключение на DLL4, който е измерен по метода SYBR Green с помощта на SsoFast EvaGreen Supermix (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). Последователността на специфичните праймери бяха както следва: колаген I: смисъл 5′-GTTCCTCCCAGCTCTCCATCAAGA-3 ′ и антисенс 5′-GCTCTGGTCACAGGGTCTCATCTC-3 ′; колаген III: смисъл 5′-GGCTTCCTGCTCTTCCATCTCTTA-3 ′ и антисенс 5′-CCTTCTCTAGGCGGCAAGTGACCT-3 ′; и трансформиращ растежен фактор (TGF) -β1: смисъл 5′-TTGCTTCAGCTCCACAGAGA-3 ′ и антисенс 5′-TGGTTGTAGAGGGCAAGGAC-3 ′. нивата на тРНК се нормализират до β-актин. Относителната експресия на иРНК се оценява, използвайки метода 2 –Ct.

Статистически анализ

Данните са представени като средна стойност ± стандартна грешка на средната стойност (SEM). Сравненията бяха извършени с помощта на еднопосочен дисперсионен анализ, последван от тест на Tukey – Kramer post hoc. P